Поглотительнаяактивностьфагоцитов.

Вкачествеобъектовфагоцитозаиспользовалисуспензиигрануллатекса(ПанЭко,РФ).Коинкубациюкрови,стабилизированнойгепарином,илатекса

осуществляливтечение45минут.Готовилимазок,окрашивалиегопоРомановскому-Гимзеипроводилимикроскопиюсиммерсией.Вкаждоммазкепосчитывалинеменее100нейтрофилов,вычисляяфагоцитарныйиндекс(ФИ)−процентклеток,содержащихфагоцитированныеобъекты,атакжефагоцитарноечисло(ФЧ)−количествогрануллатексаводномфагоците.

Метаболическаяактивностьфагоцитов.

Дляизученияреспираторноговзрыванейтрофиловinvitroиспользовалиреакциювосстановленияклеткаминитросинеготетразолия(НСТ-тест),результатучитываливусловныхединицах(у.е.).Входереакциинитросинийтетразолийвосстанавливаетсядонерастворимогодиформазана,откладывающегосявклеткахввидетемно-синихгранул.НСТ-тестпроводиликакпристимуляциинейтрофиловлатексом (индуцированныйНСТ-тест),так ибезнее(спонтанныйНСТ-тест).

ОпределениеэкспрессииТолл-подобныхрецепторов(tlRs)наклеткахкрови, клеткахкожииклеткахэпителияслизистойзева.

ОценкуэкспрессииTLRsнаМЛПК,наклеткахкожииклеткахэпителияслизистойзеваосуществлялиметодомпроточнойцитометриисприменениеммоноклональныхантител(МКА)(фирмыCaltagLaboratories,США)противсоответствующихантигенов.Клеткиотмывалихолоднымфосфатно-солевымбуфером(ФСБ)с1%фетальнойтелячьейсывороткой(ФТС)иокрашивалиFITC-иPE-меченнымиантителамисогласноинструкциипроизводителя.Затемклеткиотмывали2разахолоднымФСБс1%ФТС.РезультатыучитывалинапроточномцитометреFC-500(фирмыBeckmanCulter,США).НаМЛПКисследовалиуровниэкспрессииTLR2,TLR4,TLR9.Гейт(окно)популяцииклетокустанавливалинаосновекомбинациипрямогоибоковогосветорассеянияиразмераклеток.Приучетерезультатовподсчитывали5000клетоквгейте.

Содержаниесубпопуляцийлимфоцитов(изучениеиммунофенотипалейкоцитов)вкровипроводилисиспользованиеммоноклональныхантител

методомпроточнойцитометриинапроточномцитометреFacsCalibur(BectonDickinson,США)[76].ОпределялиотносительноеиабсолютноесодержаниелимфоцитовэкспрессирующихповерхностныемаркерыCD3⁺,CD4⁺,CD8⁺,CD16⁺,CD21⁺, CD72⁺, CD25⁺,HLA-DR⁺.

Определениеуровнясвободныхцитокиноввсыворотках/плазмекровиисупернатантахМлпк

Уровеньцитокиновопределяливсыворотках/плазмебольныхметодомтвердофазногоиммуноферментногоанализасиспользованиемтест-системфирмы

«Biosource» (Австрия)вдиапазонедетектируемыхконцентрацийот1до13пкг/млиприпомощитест-системыFlowCytomixHumanThl/Th211plexсиспользованиемшариков,сенсибилизированныхмоноклональнымиантителамикцитокинам(GM-CSF,IFN-γ,IL-1β,IL-2,IL-4,IL-5,IL-6,IL-10,IL-17,TNF-a),производства

BenderMedSystems(Австрия).УровеньцитокиновопределялисогласноинструкциипроизводителясиспользованиемпроточногоцитометраFC-500(BeckmanCulter, США).

ОпределениеуровняцитокиноввсупернатантахМЛПК.КультуруМЛинкубировали24часавростовойсредеRPMI-1640илиRPMI-1640+ФГА(5мкг/мл), затемисследовалиспонтаннуюииндуцированнуюпродукцию цитокиноввсупернатантахлейкоцитовкакописановыше.

Определениеуровнявнутриклеточныхцитокиноввклеткахкрови.Выделениемононуклеарныхлейкоцитовпериферическойкрови(млпк)

МЛПКвыделялиспомощьюодноступенчатогоградиентаплотностификолл-урографинапометодуA.Boyumпутемцентрифугирования[BoyumA.Separationofleucocytesfrombloodandbonemarrow//Scand.J.Clin.Lab.Invest.–1968.–V.267.

–P.95-99.].Лейкомассуразводилисредой199(ПанЭко,Россия),содержащей25ЕД/млгепарина(Sigma),в2раза,затемнаслаивалинаградиентплотностификолл-урографина(Pharmacia,США,плотностью1,077г/см3)споследующимцентрифугированиемпри400g40мин.МЛПК,образовавшиеинтерфазноекольцо,собиралиитрехкратноотмываливсреде199.Послекаждойотмывкив10-кратномобъемесреды,клеткиосаждалицентирифугированиемпри250g.Доводиликонцентрациюклетокдо106кл/млRPMI-1640(ПанЭко).Длястимуляциипродукциицитокиноввкультурудобавляли10мкг/млPHA(ПанЭко).Планшетыинкубировали15-60минпри37°С,5%СО2,затемвлункидобавляли10мкг/млBerefeldinA(e-Bioscience.com,США)ипомещаютвС02инкубатор(37°С)на15часов.Из каждойлункиудалялипо1млжидкости,осадокхорошоперемешивали.

Мембранноеокрашивание.Определялифенотипинтересующихклеток(субпопуляцииCD8⁺,СD16^{+лимфоцитов).}Дляэтогодобавляли3-5мклантителкповерхностнымклеточнымантигенам(согласноинструкциипроизводителя).Кклеткамдобавлялипо150мкл4%формальдегидаиинкубировали20минпритемпературе20°Свтемноте.Центрифугировали300-450g3-5мин,удалялинадосадок.Пермеабилизацияклетокилизирование.Клеткиресуспендировалив150мклPermeabilizationWashBuffer(catN421001,BioLegend,США).Дваждыоткручивалиприскорости350g втечение7мин.впермеабилизирующембуфере.

Окрашиваниецитокиноввнутриклеточно.Влункисклеткамидобавлялипо3-5мклантителкцитокинамипо30-40мклпермеабилизирующегобуфера.Инкубировали20минпритемпературе20°Свтемноте.Далееоткручивалипри300-450g3-5мин,добавляли1%формальдегид.ДанныеанализировалинапроточномцитометреFC-500(BeckmanCoulter,США)послевыделениялогическогогейтаклеточнойпопуляциивdot/plotраспределенииклетокпоих

линейномупереднему(FSC)ибоковому(SSC)светорассеянию.Приучетерезультатованализировалиминимум10000событийвгейте.