- •ПРЕДИСЛОВИЕ ПЕРЕВОДЧИКА
- •ПРЕДИСЛОВИЕ
- •СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
- •1. Введение
- •1.1. Освещение по Кёлеру
- •1.1.1. Принципы метода
- •1.1.2. Предварительная проверка оборудования
- •1.2. Установка света по Кёлеру
- •2.1. Преломление
- •2.1.1. Числовая апертура
- •2.2. Отражение, поглощение и пропускание
- •2.3. Флуоресценция/фосфоресценция
- •2.4. Поляризация
- •2.5. Дифракция
- •2.5.1. Тестовые пластинки Аббе
- •2.5.2. Формирование первичного изображения
- •2.5.3. Разрешающая способность
- •2.5.4. Роль конденсора в разрешении микроскопа
- •2.5.5. Увеличение
- •2.5.6. Увеличение и разрешение
- •4. Поле зрения
- •5. Резюме
- •6. Литература для дальнейшего чтения
- •1. Введение
- •1.1. Определение контраста
- •2. Светлопольная микроскопия
- •3. Фазовый контраст
- •3.2. Дифрагированный свет в фазовом контрасте
- •4. Темнопольная микроскопия
- •4.1. Освещение по Рейнбергу
- •4.2. Темнопольные конденсоры высокого разрешения
- •4.3. Темнопольное изображение
- •5. Поляризованный свет
- •5.1. Использование одиночного поляризатора
- •5.2. Использование скрещенных поляризаторов
- •5.2.2. Направление двулучепреломления
- •6.3. Интерференционная отражательная микроскопия
- •6.3.2. Физические основы метода
- •6.3.3. Интерпретация результатов
- •7.1. Красители
- •7.2. Использование светофильтров
- •7.3. Срезы
- •7.4. Качество препарата
- •8. Другие методы
- •8.1. Дисперсионное окрашивание
- •10. Благодарности
- •11. Литература
- •ФИКСИРОВАНИЕ ИЗОБРАЖЕНИЯ
- •1. Введение
- •2. Рисование
- •3. Фотомикрография
- •4.1. Разрешение
- •4.2. Разрешающая способность и размер отпечатка
- •4.4. Освещение
- •5. Микроскоп для фотомикрографии
- •5.1. Штатив микроскопа
- •5.2. Оптика
- •5.2.1. Числовая апертура и увеличение объективов
- •5.2.2. Исправление аберраций
- •5.2.4. Иммерсионные объективы
- •5.2.5. Глубина резкости
- •5.2.6. Кривизна поля зрения
- •5.2.7. Типы конденсоров
- •5.2.8. Чистка линз
- •6. Камера для фотомикрографии
- •6.1. Выбор размера пленки
- •6.3. Специальная фотомикрографическая камера
- •6.4. Микроскопы со встроенными фотосистемами
- •6.5. Камера с мехами
- •7. Наведение на фокус и определение экспозиции
- •7.1. Наведение на фокус
- •7.2. Определение экспозиции
- •7.3. Контроль экспозиции
- •8. Выбор условий для фотомикрографии
- •8.1. Фотографический процесс
- •8.1.1. Чувствительность пленки
- •8.1.2. Зернистость
- •8.1.3. Контрастность
- •8.2. Черно-белая фотомикрография
- •8.3. Цветная фотомикрография
- •8.3.1. Цветные отпечатки или слайды
- •8.3.2. Печать со слайдов
- •8.3.3. Цветовая температура
- •8.3.4. Коррекция цветовых искажений
- •8.3.6. Выбор чувствительности пленки
- •8.4. Поляроидные клетки
- •8.4.2. Камера Поляроид SX70
- •8.4.3. Поляроидные слайды
- •8.5. Хранение неэкспонированной пленки
- •9. Фотомакрография
- •9.1.1. Стереомикроскопы для фотомикрографии
- •9.1.2. Макроскопы
- •9.1.3. Фотомакрографические объективы
- •9.2. Освещение для фотомакрографии
- •9.3. Определение экспозиции при фотомакрографии
- •10. Завершение процесса фотомикрографии
- •10.1. Содержание записей
- •10.2. Хранение негативов
- •10.3. Хранение слайдов
- •10.4. Монтаж слайдов
- •10.5. Хранение отпечатков
- •10.6. Определение и указание увеличения
- •11. Практическое руководство
- •11.2. Начальная калибровка экспонометра
- •12. Литература для дальнейшего чтения
- •ИММУНОГИСТОХИМИЯ
- •1. Введение
- •2. Антитела
- •2.1. Структура иммуноглобулинов
- •2.2. Поликлональная антисыворотка
- •2.3. Моноклональные антитела
- •2.4. Очистка антител
- •2.5. Специфичность реакций антител
- •2.6. Хранение антител
- •3.1. Выбор условий обработки ткани
- •3.2. Выявление скрытых антигенов
- •4. Выбор способа мечения
- •4.1. Флуоресцентные метки
- •4.2. Ферментные метки
- •4.2.1. Пероксидаза хрена
- •4.2.2. Щелочная фосфатаза
- •4.2.3. Глюкозооксидаза
- •4.2.4. Галактозидаза
- •4.3. Коллоидное золото
- •4.4. Выбор метки
- •5. Методы окраски
- •5.1. Прямой метод
- •5.2. Непрямой метод
- •5.4. Системы с использованием биотин — авидина
- •5.5. Другие методы
- •6. Экспериментальные методы
- •6.1. Общее описание метода
- •6.2. Выбор правильного разведения антител
- •6.3. Флуоресцентные метки
- •6.4. Пероксидаза
- •6.4.1. Ингибирование эндогенного фермента
- •6.5. Щелочная фосфатаза
- •6.5.1. Блокирование эндогенного фермента
- •6.5.2. Мера предосторожности
- •6.6. Глюкозооксидаза
- •6.7. Галактозидаза
- •6.9. Некоторые общие процедуры
- •6.9.1. Покрытие предметных стекол
- •6.9.2. Дополнительное окрашивание
- •7.1. Контрольные препараты
- •7.2. Решение проблем
- •9. ДНК-зонды для гибридизации in situ
- •9.1. Принцип метода гибридизации
- •9.2. Экспериментальная процедура
- •9.2.1. Выявление Y-хромосомы
- •9.2.2. Выявление цитомегаловируса
- •10. Цитологические препараты
- •11. Количественная оценка
- •12. Оборудование
- •13. Благодарности
- •14. Литература
- •ГИСТОХИМИЯ И СВЕТОВАЯ МИКРОСКОПИЯ
- •1. Введение
- •1.1. Объекты для гистохимического окрашивания
- •1.1.1. Что такое окрашивание?
- •2. Приготовление и хранение срезов препаратов
- •2.1. Необходимые характеристики препарата
- •2.2. Методы приготовления и хранения препаратов
- •2.2.1. Получение тонких слоев
- •3. Что можно выявлять? Некоторые примеры
- •3.1. Выявление химических свойств
- •3.1.1. Химические фрагменты
- •3.1.2. Специфические вещества
- •3.1.3. Классы веществ
- •3.2. Выявление биологических объектов
- •3.2.1. Биологические объекты
- •3.2.2. Биологические процессы
- •3.3. Морфологические исследования
- •4. Выбор методов
- •5.1. Оценка селективности методов
- •5.2. Оценка локализации окрашивания
- •5.4. Оценка чистоты реагентов
- •5.5. Номенклатура реагентов
- •6. Что необходимо для гистохимической работы
- •6.1. Оборудование и материалы
- •6.2. Как научиться работать?
- •7. Почему используются гистохимические методы
- •8. Благодарности
- •ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ МИКРОСКОПИЯ
- •1. Введение
- •2. Флуорохромы
- •3. Флуоресцентный микроскоп
- •3.1. Способы освещения
- •3.1.1. Освещение проходящим светом
- •3.1.2. Освещение падающим светом
- •3.2. Источники света
- •3.3. Домики для ламп
- •3.4. Фильтры
- •3.4.1. Возбуждающие фильтры
- •3.4.2. Запирающие фильтры
- •3.4.3. Цветные светоделительные зеркала
- •3.5. Объективы и окуляры
- •4. Применение флуоресцентных красителей
- •4.1. Нуклеиновые кислоты
- •4.1.1. Прижизненное окрашивание флуорохромами
- •4.2. Иммунофлуоресценция
- •4.3. Флуоресценция нейромедиаторов
- •4.4. Двойное окрашивание
- •5. Микрофлуориметрия
- •5.1. Введение
- •5.2. Стандарты флуоресценции
- •5.3. Оборудование
- •5.3.1. Инвертированные микрофлуориметры
- •5.3.2. Сканирующие микрофлуориметры
- •5.4. Измерения содержания ДНК
- •5.4.1. Оборудование
- •5.4.2. Подготовка материала
- •5.4.3. Процедура окрашивания
- •5.4.4. Проведение измерений
- •6. Анализ изображения при флуоресценции
- •7. Сканирующая лазерная микроскопия
- •8. Литература
- •МИКРОМЕТРИЯ И АНАЛИЗ ИЗОБРАЖЕНИЯ
- •1. Введение
- •2. Простая микрометрия
- •2.1. Измерения длины
- •2.1.3. Окуляр-микрометр сдвига
- •2.1.4. Другие методы измерения длины
- •2.2 Измерения углов
- •2.3. Измерение толщины
- •2.4. Счетные камеры
- •2.4.2. Техника работы с гемоцитометром
- •3.1.1. Определение АA в двухфазном препарате
- •3.2. Принципы измерения площади поверхности
- •4. Измерения с использованием дигитайзера
- •5.2. Измерения с помощью компьютера
- •6. Приборы и математическое обеспечение работ
- •7. Литература
- •ВИДЕОМИКРОСКОПИЯ
- •1. Видеомикроскопия и оборудование для нее
- •1.1. Введение
- •1.1.1. Видеоусиление
- •1.1.2. Видеоинтенсификация
- •1.1.3. Цифровая обработка изображения
- •1.2.1. Условия ограниченного числа фотонов
- •1.3. Различные методы видеомикроскопии
- •1.3.1. Видеомикроскопия с усилением
- •1.3.2. Аналоговое усиление контраста
- •1.3.3. Цифровая обработка изображения
- •1.4.1. Камеры и контроллеры камер
- •1.4.5. Видеопроцессорные платы
- •1.4.6. Монофункциональные процессоры
- •1.4.7. Взгляд в будущее
- •1.5. Условия, налагаемые на микроскоп
- •1.6. Как соединить телекамеру с микроскопом
- •2.1. Различные виды VEC-микроскопии
- •2.2. Приготовление препаратов
- •2.3. Получение изображения
- •2.4. Интерпретация изображений
- •2.5. Типичные применения и ограничения метода
- •2.5.1. Светлопольная микроскопия
- •2.5.2. Темнопольная микроскопия
- •2.5.4. Фазовый контраст
- •2.5.5. Поляризационная микроскопия
- •2.5.7. Отражательная контрастная микроскопия
- •2.5.8. Флуоресцентная микроскопия
- •2.5.9. Примеры применения в биологии и биохимии
- •3.1. Введение
- •3.2. Процесс формирования изображения
- •3.2.1. Условия, касающиеся микроскопа
- •3.2.2. Получение статических изображений
- •3.2.3. Получение изображений подвижных объектов
- •3.3. Типичные приложения
- •3.3.2. Картирование отношений
- •3.3.4. Визуализация молекул
- •3.3.6. Люминесценция
- •3.3.7. Нейробиология
- •4.1. Пространственные измерения
- •4.2. Измерения по интенсивности
- •5.1. Видеозапись и редактирование
- •5.1.1. Стандарты видеотехники
- •5.1.2. Форматы видеопленок
- •5.1.3. Качество видеопленок
- •5.1.4. Видеомагнитофоны
- •5.1.5. Видеомагнитофоны с цейтраферной записью
- •5.1.6. Запись при видеомикроскопии
- •5.1.8. Копирование и редактирование видеозаписей
- •5.2.1. Оборудование
- •5.3. Перенос видеозаписей в видеофильм
- •5.4. Рисование с монитора
- •6. Благодарности
- •7. Литература
- •1. Введение
- •2. Классификация сегментов хромосом
- •2.1. Гетерохроматиновые сегменты
- •2.2. Эухроматиновые сегменты
- •2.3. Ядрышковые организаторы
- •2.4. Кинетохоры
- •4.2. G-окрашивание
- •4.2.1. ASG-метод
- •4.2.3. Метод Галлимора и Ричардсона
- •4.3. R-окрашивание
- •4.4. Q-окрашивание
- •4.4.1. Q-окрашивание с помощью акрихина
- •4.5.2. Процедура окраски
- •5.1. Окрашивание ДАФИ/дистамицином
- •5.2.1. Метод культивирования клеток
- •5.2.2. Методика окраски
- •5.3.2. Синхронизация с помощью БУДР [39]
- •5.3.3. Синхронизация с помощью ФУДР [13, 40]
- •6. Наблюдение и регистрация сегментов хромосом
- •6.3. Фотографирование сегментированных хромосом
- •6.4.1. Получение профилей сегментов
- •6.4.2. Отражательная микроскопия
- •6.4.3. Измерение полиморфизма хромосом
- •7. Благодарности
- •8. Литература
- •9. Литература для дальнейшего чтения
Q-сегменты различаются по своей яркости, но не по размерам. Рекомендуется субъективно сравнивать их с другими, неполиморфными районами хромосом [51], однако здесь мешает то, что общий уровень флуоресценции в пределах одной метафазной пластинки может варьировать. Если полиморфизм Q-сегментов исследуют на фотографиях, то необходимо удостовериться, что при фотографическом процессе содержащаяся в изображении информация не потерялась. Овертон и др. [63] рекомендуют печатать фотографии, используя серию различных выдержек, чтобы Q-сегменты всех уровней яркости могли хорошо зафиксироваться на отпечатке. Шнедл и др. [61] описали применение профилей сегментации для измерения яркости полиморфных районов. Это действительно полезный метод, хотя без специальных предосторожностей измеряемые величины не будут пропорциональны интенсивности исходной флуоресценции. Подробное обсуждение проблем, связанных с получением количественных данных с помощью флуоресценции, можно найти у Ван-дер-Плога и др. [62].
Хотя и не существует универсального метода для измерения полиморфизмов хромосом, тем не менее во всех случаях, когда это возможно, нужно пытаться проводить измерения, поскольку очень важно пользоваться количественными данными, а не субъективными впечатлениями. Для этого могут применяться системы анализа изображения с высоким разрешением, которые находят в последнее время все большее применение. В любом случае результаты измерений зависят от качества исходной окраски, от настройки микроскопа, которая должна быть оптимальной, и, если используется фотография, от тщательности воспроизведения изображения. Чтобы получить достоверные количественные данные и достичь наилучших результатов, необходимо понимать суть происходящих процессов и обращать внимание на детали.
7. Благодарности
Я хотел бы поблагодарить д-ра Джона Госдена (John Gosden), за предоставление метода приготовления спермидин-бис-акридина; мистера Нормана Дэвидсона (Norman Davidson) за советы по технике фотографии и м-ра Джорджа Споварта (George Spowart) за общие советы по методам дифференциального окрашивания. Несколько фирм любезно предоставили необходимую информацию о производимых ими флуоресцентных микроскопах. Я особенно благодарен миссис Энн Кенмур (Ann Kenmure), которая печатала данную рукопись, и отделу фотографии в MRC Human Genetics Unit за подготовку иллюстраций.
8. Литература
1.Sumner, Д. Т. (1982) Cancer Genet. Cytogenet., 6, 59,
2.Heitz, E. (1929) Ber. Dtsch. Bot. Ges., 47, 274.
3.John, B. and King, M. (1977) Chromosoma, 65, 59.
4.Camacho, J. P. M., Viseras, E., Navas, L and Cabrera, I. (1984) Heredity, 53, 167.
5.Ochs, R. L. and Busch, H. (1984) Exp. Cell Res., 152, 260.
6.Markovic, V. D., Worton, R. G. and Berg, J. M. (1978) Hum, Genet., 41, 181.
7.Moroi, Y., Peebles, C., Fritzler, M. J., Steigerwald, L. and Tan, L. M. (1980) PNAS, 77, 1627.
8.Pfeiffer, R. A. (1974) In Schwarzacher, H. G Wolf, U. and Passarge, E. (eds) Methods in Human Cytogenetics. Springer-Verlag, Berlin, p. 1.
9.Zackai, E. H. and Mellman, W. L (1974) In Yunis, J. J. (ed.), Human Chromosome Methodology. Academic Press, New York, 2nd edition, p. 95.
10.Macgregor, H. C. and Varley, J. M. (1983) Working with Animal Chromosomes. John Wiley and Sons, Chichester.
11.Watt, J. L. and Stephen, G. S. (1986) In Rooney, D. E. and Czepulkowski, B. H. (eds), Human Cytogenetics: A Practical Approach. IRL Press, Oxford, p. 39.
12.Worton, R. G. and Duff, C. (1979) In Jakoby, W. B. and Pastan, I. H, (eds), Methods in Enzymology. Academic Press, New York, Vol. 58, p. 322.
13.Harrison, S. /. (1986) In Rooney, D. E, and Gzepulkowski, В. Н, (eds), Human Gytogenetics: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, p« 135.
14.Darlington, C. D. and La Cour, L. F. (1969) The Handling of Gnromosomes. George Allen and Unwin, London, 5th edition, p. 43.
15.Schwarzacher, Т., Ambros, P. and Schweizer, D. (1980) Plant Syst. Evol., 134, 293.
16.Evans, E. P., Breckon, G. and Ford, С. Е. (1964) Cytogenetics, 3, 289
17.Breckon, G. (1982) Stain Technol., 57, 349.
18.Hungerford, D. A. (1971) Cytogenetics, 10, 23
19.Sumner, A. T. (1972) Exp. Cell Res., 75, 304.
20.Chandley, A. C. and Fletcher, J. M. (1973) Humangenetik, 18, 247.
21.Sumner, А. Т., Evans, H. J. and Buckland, R. A. (1971) Nature New Biol 232, 31.
22.Seabright, M. (1972) Chromosoma, 36, 204.
23.Gallimore, P. H. and Richardson, C. R. (1973) Chromosoma, 41, 259.
24.Sehested, J. (1974) Humangenetik, 21, 55.
25.Buckton, K. E. (1976) Int. J. Radiat. Biol., 29, 475.
26.van de Sande, J. H., Lin, C. C. and Deugau C. V. (1979) Exp. Cell Res 120, 439. 55.
212
27.Howell, W. M. and Black, D. A. (1980) Experientia, 36, 1014.
28.Tantravahi, R., Miller, D. A. and Miller, 0. J. (1977) Cytogenet. Cell Genet, 18, 364.
29.Howell, W. M. and Black, D. A. (1978) Human Genet. 65, 144.
30.Schweizer, D., Ambros, P. and Andrle, M. (1978) Exp. Cell Res., 111, 327.
31.Donlon, T. A. and Magenis, R. E. (1983) Human Genet., 65, 144.
32.Benn, P. A. and Perle, M. A. (1986) In Rooney, D. E. and Czepulkowski, В. Н. (eds), Human Cytogenetics: A Practical Approach. IRL Press, Oxford, p. 57.
33.Schmidt, M., Stolzmann, W. M. and Baranovskaya, L. (1982) Chromosoma, 85, 405.
34.Willard, H. F. (1977) Chromosoma, 61, 61.
35.Perry, P. and Wolff, S. (1974) Nature, 251, 156.
36.Wolff, S. (1977) Annu. Rev. Genet., 11, 183.
37.Limon, L and Gibas, Z. (1985) In Sandberg, A. A. (ed.), The Y Chromosome, Part A: Basic Characteristics of the Y Chromosome. Alan R. Liss, New York, p. 317.
38.Yunis, J. J. (1976) Science, 191, 1268.
39.Dutrillaux, B. and Viegas-Pequignot, E. (1981) Human Genet., 57, 93.
40.de Braekeleer, M., Keushnig, M. and Lin, C. C. (1985) Can. J. Genet., Gytol., 27, 622.
41.Kao, Y. S., Whang-Peng, J. and Lee, E. (1983) Am. J. Clin. Pathol., 79, 481.
42.Ikeuchi, T. (1984) Cytogenet. Cell Genet., 38, 56.
43.Bradbury, S. (1984) An Introduction to the Optical Microscope. Oxford University Press, Oxford.
44.Wulf, H. C. (1983) Mikroskopie, 40, 1.
45.Ploem, J. S. and Tanke, H. J. (1987) Introduction to Fluorescence Microscopy. Oxford University Press, Oxford.
46.Davidson, N. R. (1973) J. Med. Genet., 10, 122.
47.Wayne, A. W. and Sharp, J. C. (1981) J. Microsc., 124, 163.
48.Sumner, A. T. and Finlayson, D. (1978) J. Microsc., 114, 85.
49.Piper, J. (1982) Anal. Quant. Cytol., 4, 233.
50.Enk, D. and Pawlowitzki, I. H. (1987) J. Microsc., 143, 301.
51.ISCN (1978) Cytogenet. Cell Genet., 21, 309.
52.Patil, S. R. and Lubs, H. A. (1977). Human Genet., 38, 35.
53.Cohen, M. M., Shaw, M. W. and MacCluer, J. W. (1966) Gytogenetics, 5, 34.
54.Sumner, A. T. (1977) Cytogenet. Cell Genet., 19, 250.
55.Cavalli, I. J., Mattevi, M. S., Erdtmann, В., Sbalqueiro, L and Maia, N. A. (1985) Human Hered., 35, 379.
56.Mason, D., Lander, L, Rutovitz, D. and Spowart, G. (1975) Comput. Biol. Med., 5, 179.
57.Lopetegui, P. H. (1980) Japan J. Hum. Genet., 25, 29.
58.Drets, M. E. and Seuanez, H. (1974) In Coutinho, E. M. and Fuchs, F. (eds), Physiology and Genetics of Reproduction, Part A. Plenum Publishing Corporation, New York, p. 29.
59.Wegner, H. and Pawlowitzki, I. H. (1981) Human Genet., 58, 302.
60.Schmid, M., Loser, C., Schmldtke, 7. and Engel, W. (1982) Chromosoma, 86, 149.
61.Schnedl, W., Roscher, U. and Czaker, R. (1977) Human Genet., 35, 185.
62.van der Ploeg, M., Vossepoel, A. M., Bosman, F. T. and van Duiln, P. (1977) Histochemistry, 51, 269.
63.Overton, C. M., Magenis, R. E., Brady, Т., Chamberlin, I. and Parks, M. (1976) Am. J. Human Genet., 28, 417.
9. Литература для дальнейшего чтения
MacGregor, H. C. and Varley, J. M. (1983) Working with Animal Chromosomes. John Wiley and Sons, Chichester. Rooney, D. E. and Czepulkowski, B. H. (1986) Human Gytogenetics: A Practical Approach. IRL Press, Oxford.
213