7.Проведите анализ движений с помощью стандартных методов временного анализа, таких как автокорреляция и быстрые преобразования Фурье для колебательных процессов или перекрестный корреляционный анализ для выявления подобия в характере движения различных органелл.

8.Если объект трудно выделить за счет контраста, но глаз его различает, то следует провести интерактивный анализ одиночных кадров. Для этой цели воспользуйтесь видеомагнитофоном со «стопкадром»; с каждого последующего, либо с пятого или десятого кадра выделите, перемещая вручную (курсор, координаты частицы, например конца микротрубочки [38].

Одновременный анализ множества движущихся объектов, таких как органеллы, подвижные микроорганизмы или сперматозоиды, можно проводить с помощью специального оборудования для анализа подвижности (например, фирмы Motion Analysis Inc. или Mitec GmbH).

4.2. Измерения по интенсивности

Интенсивность каждого элемента картинки представлена Б виде числа; в случае изображений, оцифрованных с точностью до 8 бит, это одно из чисел от 0 до 256. В изображении, получаемом с помощью микроскопа, интенсивность отражает, в зависимости от используемой техники, поглощение, запаздывание фазы, интенсивность флуоресценции или двулучепреломление. Если мы уверены, что только один из вышеперечисленных факторов участвует в формировании изображения, то можно количественно определить его в различных элементах изображения. Это легко сделать для поглощения, применяя монохроматический свет в светлопольной микроскопии, и для флуоресценции, используя специфические флуорохромы. Определить отдельный вклад в изображение других параметров значительно труднее.

Следует пояснить, что в фотометрах, работающих с кюветами или встроенных в микроскопы, для измерения интенсивности света с высокой точностью используются установленные перед фиксированной щелью или диафрагмой фотоумножители, которые дают ошибку порядка нескольких тысячных (оптической единицы). С другой стороны, измерение интенсивности на телевизионном изображении хотя и дает максимальное разрешение лишь в 256 уровней серого, но имеет то преимущество, что информация получается с пространственным разрешением 512x512 пикселов. Интенсивность, получаемая в видеоизображении,— это результирующая многих стадий, и она не обязательно будет изменяться линейно и соответствовать закону Ламберта — Бэра. Поэтому, если нужно получить абсолютные величины, необходимо откалибровать прибор, используя стандартный препарат. Последнее требование, а также сравнительно низкое разрешение по интенсивности являются двумя большими недостатками данного метода.

Можно исследовать распределение поглощающих и флуоресцирующих составляющих в биологических образцах в пространстве или во времени. Существуют системы, позволяющие считывать интенсивность одного пиксела, а также интенсивность вдоль линии (рис. 8.4) или внутри заданной рамки (рис. 8.12). При исследовании пространственного распределения такие измерения дают информацию о диффузии и транспорте веществ, которые были поглощены клеткой либо инъецированы в нее. Если осветить препарат или его часть, то данный метод можно использовать для измерения фотообесцвечивания или восстановления флуоресценции после обесцвечивания (FRAP-метод) при исследованиях флуоресцирующих компонентов [44, 45].

Большинство измерений позволяют только оценить количество данного вещества на пути световых лучей, но в некоторых случаях можно измерить и концентрации. Это делается в случае, если два изображения делятся друг на друга и представляется их частное [41—43], с помощью которого определяют концентрации Са2+ (рис. 8.12) или Н+ (рН) [41, 43] в живых клетках.

Данные методы, которые применяются для биохимического анализа с помощью микроскопа, т.е. для определения количества и концентрации специфических молекул вплоть до ферментов, находятся сейчас в стадии быстрого развития. Для выявления отдельных органелл, клеток, ферментов и мембран выпускаются сотни флуоресцентных маркеров, которые могут быть использованы в живых клетках для обнаружения и анализа тех или иных свойств [55] (они производятся, например, фирмой Molecular Probes Inc.). Описание различных способов применения данных маркеров не входит в задачи настоящей главы (см. ссылки в разд. 3.3

и8.3).

5.Документация и представление видеомикроскопических данных

Только профессиональное использование видеотехнологии позволяет сделать видеомикроскопию полезным лабораторным методом. Цель настоящего раздела — познакомить начинающего исследователя с основными сведениями, относящимися к данной технологии, которая может оказаться новой для многих биологических лабораторий. Поскольку изображения, получаемые с помощью видеомикроскопии, нельзя непосредственно наблюдать и фотографировать через микроскоп, то следует научиться тому, как правильно записывать их, а затем — как получать копии с видеомонитора в виде фотографий, рисунков или пленок.

5.1. Видеозапись и редактирование

Видеомагнитофоны незаменимы для хранения изображений, получаемых с помощью видеомикроскопии. В них удобно хранить информацию, поскольку они просты в обращении и дают возможность производить на одну ленту запись продолжительностью до 6 ч. Записи могут быть немедленно проиграны и исследованы без

178

обработки (в отличие от видеофильмов).

Прежде чем приобретать видеооборудование, следует разобраться в существующих стандартах, форматах и взвесить все преимущества и недостатки каждой конкретной системы.

5.1.1. Стандарты видеотехники

В мире имеется несколько телевизионных стандартов цветного изображения. Во многих европейских странах, Австралии и многих африканских странах используется западногерманский стандарт PAL (от англ, phase alternation line); во Франции, некоторых африканских и большинстве восточноевропейских стран используется французская система SEKAM (от франц. Sequentielle a Memoire). Система NTSC (от англ. National Television System Committee), разработанная в США, является стандартной для Северной Америки, многих стран Центральной и Южной Америки, а также Японии. Полный список телевизионных систем для всех стран можно получить в магазинах по продаже видеотехники.

Американский стандарт отличается от европейского в основном скоростью развертки. В NTSC на экран выводится 30 кадров в секунду, каждый кадр состоит из 525 линий горизонтальной развертки. Поскольку каждый кадр разделен на два перекрывающихся полукадра, то частота 30 кадров в секунду означает 60 полей в секунду. Таким образом, скорость в системе NTSC обозначается как 525/60. Оба европейских стандарта имеют скорость 625/50, то есть 25 кадров в секунду при 625 линиях сканирования.

Эти различия в развертке означают, что невозможно скопировать запись, сделанную в системе PAL, на оборудовании, предназначенном для системы NTSC, и наоборот. Для трансляции записей с PAL/SEKAM на NTSC и наоборот требуется специальное оборудование, которое доступно только для больших коммерческих видеостудий или телецентров. Такая трансляция может быть сделана с минимальной потерей качества, на за очень высокую плату. Впрочем, в настоящее время разрабатывается микросхема для конверсии NTSC/PAL, и скоро она может стать доступной для потребителей.

Термины PAL, SEKAM и NTSC характеризуют только цветовые стандарты. Однако они полностью совместимы с соответствующими черно-белыми стандартами, а именно PAL и SEKAM—с CCIR (частота 50 Гц) и NTSC — с EIA (60 Гц). Рекомендуется приобретать оборудование для цветного изображения (мониторы и магнитофоны), так как оно позволяет записывать черно-белый сигнал и псевдоцветное изображение (разд. 1.7), которое становится все более популярным в видеомикроскопии.

Необходимо, чтобы все части видеооборудования были совместимы друг с другом. Это означает, что все разъемы должны иметь один и тот же телевизионный стандарт. Не следует подсоединять американскую NTSCвидеокамеру к европейскому видеомагнитофону системы PAL. Большинство видеомагнитофонов совместимы только с одной из телевизионных систем, тогда как большинство мониторов принимают сигналы на частотах 50 и 60 Гц. Однако некоторые профессиональные видеомагнитофоны могут использовать все три стандарта, например магнитофоны Sony VO-5630 или JVC 158 MS, работающие на пленке шириной 3/4 дюйма. Такое универсальное оборудование необходимо вам для того, чтобы обмениваться пленками с коллегами на других континентах.

5.1.2. Форматы видеопленок

В научно-исследовательских лабораториях, как правило, используются видеопленки двух форматов. Они имеют ширину 1/2 дюйма (1/2") или 3/4 дюйма (3/4"). Оба типа пленок поставляются в кассетах, но пленка 1/2" иногда используется на катушках.

I. Формат 1/2 дюйма. Этот формат представляет собой хорошо известный видеостандарт для домашнего пользования. Кассеты для формата VHS не совместимы с кассетами для формата Beta. Ожидается, что формат VHS станет общемировым стандартом для пленок 1/2". Преимуществами формата 1/2" являются низкие цены на магнитофоны и пленки. Однако эта пленка тоньше и уже, чем пленка 3/4", что ведет к большему числу пробоев на ней (маленькие белые вспышки) и появлению шумовых искажений при повторных проигрываниях по сравнению c пленкой в 3/4 дюйма.

Большинство высококачественных видеомагнитофонов дают возможность монтировать видеоряд. Это означает, что вы можете легко добавлять картины без того, чтобы они накладывались друг на друга (разд. 5.1.8,111). Некоторые видеомагнитофоны высокого класса (например, фирмы JVC) позволяют редактировать даже в режиме вставки.

Недавно США и Япония выпустили в продажу улучшенные видеомагнитофоны бытового стандарта, называемые Super-VHS (S-VHS). В системе Super-VHS используются кассеты того же формата, что и в стандартной системе VHS, но первая имеет большее разрешение (400—430 линий по вертикали). Другим ее преимуществом является то, что качество при копировании сравнимо с качеством, получаемым на пленке 3/4". Новые магнитофоны совместимы со стандартными VHS, но не наоборот. Тем не менее, заказывая новое оборудование в стандарте VHS, следует проверить его работу.

II. Формат 3/4 дюйма. Видеомагнитофоны формата 3/4" (кассеты U-типа) широко распространены в научных лабораториях и среди других полупрофессиональных пользователей. Стоимость магнитофонов и кассет формата 3/4" примерно в 5 раз выше, чем стоимость оборудования для формата 1/2". Их ценность заключается в более высоком качестве записи на пленку, изготовленную из более прочного и толстого материала. Это существенно в тех случаях, когда необходимо часто пользоваться стоп-кадром или поиском

179

нужного кадра, поскольку процедура поиска на видеомагнитофоне сильно повреждает пленку. Кроме того, копии, получаемые с одной пленки 3/4" на другой, имеют практически такое же качество, как оригинал. Больший формат позволяет получить разрешение по вертикали в 340 линий вместо 250—300 линий на формате 1/2" (черно-белое изображение).

Видеомагнитофоны для формата 3/4" выпускаются в двух вариантах — «низкоскоростные» и «высокоскоростные». Более дорогие высокоскоростные магнитофоны позволяют благодаря большей скорости протяжки пленки получить более высокое разрешение и более четкое изображение '(особенно в цвете). Чернобелые пленки взаимозаменяемы для двух типов магнитофонов, тогда как цветные записи, выполненные на высокоскоростных магнитофонах, могут проигрываться только на них.

Формат 3/4" представляет собой удачный компромисс между бытовым видеоформатом 1/2" и полностью профессиональным форматом в 1" или 2", которые используются в телецентрах. Последние типы пленок требуют очень дорогостоящих и массивных видеопроигрывателей и обычно — специального обслуживающего персонала.

Если ваши видеомагнитофоны имеют один и тот же стандарт (например, NTSC), то проблем в копировании с одного формата на другой не возникает. Следует помнить однако, что при копировании с 3/4" на 1/2" вы потеряете в качестве, а при копировании с 1/2" на 3/4" не получите большего разрешения.

5.1.3. Качество видеопленок

Магнитные пленки для видеозаписи выпускаются различного качества. Для видеомикроскопии, где при записи требуются высокая плотность и низкий шум, пригодны только пленки высокого качества. Кроме того, существуют специальные пленки для работы в режиме стоп-кадра, который часто используется в видеомикроскопии. Они имеют меньше дефектов и делаются из очень прочного материала. Кассеты такого типа с пленкой 3/4 дюйма маркируются «КСА» или KCS» — ленты высшего качества — с дополнительной надписью «Телевизионное качество». Эти профессиональные пленки рекомендуются специально для записей в цвете. Кроме того, пленки высокого качества более устойчивы к истиранию, и при работе с ними лучше сохраняются головки магнитофонов.

Максимальное время записи на кассету типа VHS (1/2") составляет 6 часов, но лучше использовать кассеты со временем записи 1—2 часа. Выпускаются кассеты U-типа (3/4"), рассчитанные на время записи 20, 30 или 60 минут.

5.1.4. Видеомагнитофоны

Используемые в видеомикроскопии видеомагнитофоны должны обладать некоторыми специальными свойствами. Так, например, в тех случаях, когда необходимо получать фотографии с монитора, может потребоваться хороший стоп-кадр. Для этой цели большинство видеомагнитофонов имеют кнопку «пауза». Выводимый на экран кадр должен быть контрастным и стабильным, без дрожания и мерцания. Для того чтобы проводить покадровый просмотр, необходим плавный переход от одного кадра к другому. Некоторые видеомагнитофоны имеют систему прямого и обратного поиска, позволяющую перемещать пленку вперед и назад от одной сцены к другой без долгой процедуры остановки, перемотки и повторного запуска проигрывания.

Для того чтобы иметь возможность вставить в видеофильм комментарии без стирания записи, вам потребуется магнитофон с системой быстрой звукозаписи (AUDIO DUB). Большинство таких магнитофонов имеют два звуковых канала, которые могут проигрываться независимо или синхронно. Полезно также иметь контроль времени записи/проигрывания пленки, особенно в тех случаях, когда видеомагнитофон находится не под руками. Блок управления может быть подсоединен к магнитофону проводами или управляться с помощью инфракрасного излучателя.

5.1.5. Видеомагнитофоны с цейтраферной записью

Многие биологические объекты, например медленно движущиеся частицы или клетки в процессе деления, требуют замедленной записи. Видимыми такие движения могут становиться только при ускоренном воспроизведении. Цейтраферный магнитофон может использоваться параллельно с обычным, что дает возможность сравнивать последовательность событий в реальном времени и при ускорении. Записанные ранее в реальном времени процессы также могут быть ускорены с помощью цейтраферного магнитофона. Однако при этом надо следить за совпадением синхроимпульсов (разд. 5.1.8,11).

Существует несколько типов цейтраферных видеомагнитофонов, но все они являются, строго говоря, «долгозапишвающими». Они спроектированы так, чтобы вести запись в течение 400 к более часов на стандартную 3-часовую пленку. При нормальном проигрывании записи большинство из этих видеомагнитофонов дают значительную интерференцию и шумовые полосы. Как правило, удовлетворительное качество изображения дают только системы, имеющие ускорение при проигрывании в 8 раз или меньше. Вместе с тем со всех типов цейтраферных видеомагнитофонов можно получать чистые стоп-кадры.

Прежде чем приобретать цейтраферный видеомагнитофон, следует проверить все доступные для вас типы, поскольку каждый имеет свои преимущества и недостатки. Большинство цейтраферных видеомагнитофонов разработано для формата 1/2", например те, которые выпускаются фирмами Sony, GYYR, Panasonic и Hitachi. В

180

настоящее время только фирма JVC выпускает цейтраферный магнитофон для пленки шириной 3/4". Цейтраферные видеомагнитофоны действительно высокого качества выпускаются только для форматов 1" или 2".

Для цейтраферных видеомагнитофонов используются стандартные кассеты 1/2" и 3/4", но сделанные на них записи не могут проигрываться с нормальной скоростью на обычных магнитофонах того же формата. Во время цейтраферной записи пленка медленно движется мимо головок, вращающихся с нормальной скоростью, которые, таким образом, царапают пленку. По этой причине для записи следует пользоваться только новыми пленками наивысшего качества (разд-5.1.3). Если возможно, необходимо копировать цейтраферные записи на обычных магнитофонах с форматом 1/2" или 3/4" для того, чтобы защитить их от дальнейших нагрузок.

Иногда вместо цейтраферных видеомагнитофонов используются мультипликационные блоки управления

(например, EOS АС 508 производства EOS Electronics AV Ltd, юли IT-2 производства AVT GmbH). Для редактирования эти блоки црисоединяются к видеомагнитофону (например, Sony VO-5850). Они позволяют записывать один или несколько кадров с интервалом 10—999 с. При проигрывании в реальном времени такие записи дают по крайней мере 100-кратное ускорение, но изображение в них свободно от искажений. Мультипликационные блоки хорошо подходят для документирования очень медленных процессов, таких как рост клеток, их движение, или деление [56].

5.1.6. Запись при видеомикроскопии

Перед началом работы необходимо убедиться, что все разъемы и переключатели находятся в правильных положениях. Один из возможных вариантов соединения системы для видеомикроскопии показан на рис, 8.13. Видеомагнитофон должен получать сигнал непосредственно от видеопроцессора, а не «из вторых рук» через монитор. Поэтому видеосигнал должен сначала проходить через видеомагнитофон, а затем подаваться на монитор. Таким образом получается электронная система соединения. Для некоторых магнитофонов электронная система соединения может быть достигнута только при включенной на магнитофоне кнопке «запись».

Если монитор является конечным получателем видеосигнала,, то его следует «заглушить». Это означает, что 75-омный переключатель на задней панели монитора должен быть поставлен в положение «75 Ом включено». На мониторах, работающих в режиме электронной системы соединения, переключатель должен стоять в положении «HI-Z». Аналогичным образом это должно быть выставлено для всех остальных компонентов видеосистемы. Если на выходе нет переключателя 75 Ом/HI-Z, то выходной разъем должен быть замкнут разъемом, содержащим сопротивление 75 Ом.

При обработке изображения его яркость и контраст изменяются с помощью электронного оборудования. Поэтому очень важно установить яркость и контрастность монитора в стандартное положение и оставить их такими на все время работы. Такая установка даст картины одинакового уровня яркости, которые легко сопоставлять при дальнейшей обработке и редактировании.

Большинство видеопроцессоров вносит в кадр время и размерную шкалу. Для того чтобы получить правильное увеличение, особенно при фотографировании с монитора (разд. 5.2), запишите на видеомагнитофон шкалу объект-микрометра дважды — в горизонтальном и вертикальном положениях. Данная запись используется для калибровки шкалы или линейки, которую выводит компьютер (рис. 8.4), либо для установки горизонтальных и вертикальных размеров на мониторе (разд. 5.2.2).

Иногда на записанном изображении вы можете заметить пятна, которые не были видны в процессе записи. Поэтому полезно время от времени записывать также фоновое (расфокусированное) изображение, соответствующее основному видеоряду. В таком случае вы сможете в дальнейшем удалить искажения с помощью дополнительной обработки изображения.

Чересчур высокий уровень видеосигнала дает на экране «снег» и большое количество шумов при проигрывании на видеомагнитофоне. Для того чтобы избежать этого, следует проверять величину сигнала (на выходе анализатора изображения или видеомагнитофона) с помощью осциллографа. На смешанном сигнале разность между пиками не должна превышать (по стандартам) 1,0 В (на само изображение приходится 0,7 В и 0,3 В — на синхроимпульс). Больший чем 1,0 В уровень видеосигнала вызывает искажения в светлых частях изображения. Поэтому уровень записи следует проверять, проигрывая ее. Если окажется, что видеосигнал слишком велик, следует вызвать представителя сервисной службы, чтобы он уменьшил величину выходного сигнала настолько, чтобы сигнал не мог превышать 1,0 В.

Уровень видеозаписи контролируется автоматически, а уровень записи звука на некоторых видеомагнитофонах можно регулировать вручную. Большинство видеомагнитофонов снабжены устройством, ограничивающим звук, которое сводит к минимуму его искажения при максимальной громкости.

Ори работе на микроскопе очень полезно записывать комментарии к тому, что вы делаете, например отмечать такие вещи, как смену объектива, положение фокальной плоскости в препарате (на рис. 8.13 указан используемый для этой цели микрофон). Если видеомагнитофон имеет два раздельных звуковых канала и систему ускоренной перезаписи звука, то для комментариев следует использовать второй канал, так как после записи дополнительные комментарии могут быть записаны только на первый канал.

Пленки с записью могут быть защищены от нечаянного стирания. Для этого на кассетах U-типа следует удалить красную кнопку на нижней части, а на кассетах стандарта 1/2" —отломить сзади пластиковый кончик. Если впоследствии вы захоти те снова произвести запись на эти пленки, то установите на место кнопку или заклейте липкой лентой проломленное окошко Непреднамеренное использование защищенных от стирания

181