столиком. Примерами исследований, проводимых с помощью инвертированных микроскопов, являются иммунологические реакции в панелях для микротитрования (96-луноч-ные) или панелях Терасаки (60луночные). Микрофлуориметр может быть снабжен управляемыми через компьютер шаговыми двигателями для перемещения столика вдоль рядов и линий ячеек, в которых необходимо произвести измерения.

5.3.2. Сканирующие микрофлуориметры

Сканирующая флуориметрия может дать возможность лучшей интерпретации результатов в тех случаях, когда объекты нельзя достаточно хорошо изолировать от фона и поместить в центр поля измерительной диафрамы. Сканирующие микрофлуориметры подразделяются на те, которые сканируют препарат (в них имеется сканирующий столик и перемещающееся пятно), и те, которые сканируют изображение, например телевизионные сканнеры (разд. 6). Сканирующий столик передвигается с помощью шаговых моторов, работающих под контролем компьютера. Для этой цели может быть приспособлен обычный микрофлуориметр.

Сканирование при микрофлуориметрии оказалось очень полезным для локализации флуоресценции в нейронах и межнейронном пространстве. Математический анализ гистограмм, получающихся в результате сканирования по площади (50 X Х50 мкм), дает детальную информацию об интенсивности флуоресценции, индуцированной формальдегидом, в нейронах, межнейронном пространстве или в иммунологически меченных участках нейронов [37].

5.4. Измерения содержания ДНК

В качестве иллюстрации возможностей метода микрофлуориметрии мы приведем исследования на клетках шейки матки, проводимые в нашей лаборатории [38]. В этой работе микрофлуориметрия использовалась для измерения содержания ДНК в ядрах клеток. Целью было установить, действительно ли в предраковых и раковых очагах в шейке матки всегда имеются клетки с содержанием ДНК большим, чем 5С, и действительно ли данные клетки отсутствуют в препаратах, где таких очагов нет. Работа выполнялась на приборе MPVII (Leitz, ФРГ), снабженном системой проходящего света для поиска клеток, которые нужно измерять, и системой эпиосвещения для проведения измерений. Для этих целей может использоваться любой микрофлуориметр, если только микроскоп снабжен системами для проходящего и падающего света. Конкретно для данной задачи использовалась следующая методика и оборудование.

5.4.1. Оборудование

1.Микроскоп с микрофлуориметром, снабженный двумя ртутными лампами — НВО 200 для проходящего света с источником переменного тока и НВО 100 для падающего света и проведения измерений с источником постоянного тока (рис. 6.7).

2.Наблюдения в проходящем свете проводились при фиолетовом свете (425 нм) для того, чтобы после окраски АФС-методом были видны ядро и цитоплазма (разд. 5.4.3). После теплопоглощающего фильтра устанавливалась комбинация фильтров для возбуждения SP 425 + 3 мм BG 3. Свет флуоресценции проходил через дихроичное зеркало (470 нм), необходимое для эииосвещения. В качестве запирающего использовался фильтр LP 460.

3.Для измерений использовалось эпиосвещение. Свет для возбуждения окрашенных акрифлавином ядер имел длину волны 485 нм (синий). После теплопоглощающего фильтра устанавливалась следующая комбинация фильтров: LP 475 + + 2XSP 490 + 4 мм BG 38. Для эпиосвещения требуется установить в ходе лучей дихроичное зеркало, которое в данном случае было марки DM 470. Следует заметить, что в случае возбуждения синим светом данное дихроичное зеркало не является оптимальным, но оно применяется в качестве компромиссного варианта, поскольку позволяет использовать возбуждение при длине волны 405 нм и проводить измерения при длине волны 485 нм. В качестве запирающего использовался фильтр LP 590.

4.Применялись масляно-иммерсионные объективы X25/0,75 (для поиска клеток) и планапохромат X 63/1,4 (для проведения измерений).

5.Флуоресценцию, возбуждаемую проходящим светом, наблюдали с помощью окуляров (Х6,3), а флуоресценция от падающего света направлялась непосредственно в ФЭУ. После преобразования сигнала из ФЭУ в аналогово-цифровом преобразователе (АЦП) результаты можно было получать с помощью микрокомпьютера.

6.Для того чтобы избавиться от вносимых фоном искажений, применялась диафрагма с изменяемым диаметром отверстия. Полевая диафрагма при эпиосвещении устанавливалась таким образом, что освещаемая область была лишь немного больше той области, в которой проводились измерения, чтобы предотвратить обесцвечивание препарата в остальной части поля зрения.

7.Для переключения с проходящего на падающий свет использовались электронные затворы. Нажатием кнопки они включались одновременно с автоматической измерительной системой.

5.4.2. Подготовка материала

1.Соскребите клетки с шейки матки с помощью тампона из шерсти с акрилом. Поместите тампон в сохраняющий раствор [физиологический фосфатный буфер (ФСБ) или полиионный раствор с 25% этанола].

2.Взболтайте раствор для удаления клеток с тампона и осадите клетки с помощью центрифугирования.

126

3.Ресуспендируйте осадок в 0,5 мл фиксатора Эспости (уксусная кислота : метанол : дистиллированная вода

всоотношении 7:33:30).

4.Для диссоциации клеток пропустите суспензию 50 раз шприцем через иголку № 21, затем добавьте к суспензии лимфоциты (выделенные из свежей крови после центрифугирования).

5.Сделайте препарат, нанеся две капли суспензии на предметное стекло.

6.Высушите препарат в течение 30 мин при 50 °С в парах параформальдегида.

7.Непосредственно перед окрашиванием зафиксируйте препарат раствором Карнуа (15 мин).

5.4.3. Процедура окрашивания

Процедура окраски АФС-методом.

1.Промойте препарат водой два раза по 3 мин.

2.Проведите гидролиз 30 мин в 5 М НС1 (при 28 °С) и снова промойте препарат водой в течение 3

мин.

3.Окрасьте препарат 0,01%-ным раствором акрифлавина (Chroma, ФРГ) в течение 15 мин (при 28 °С), а затем обработайте 10 мин 1 М НС1 в 70%-ном метаноле.

4.Промойте препарат водой в течение 5 мин.

5.Добавьте на 15 мин 0,01% СИТЦ (Polyscience, Великобритания), приготовленный на фосфатном буфере (рН 7,6).

6.Промойте препарат в течение 3 мин водой, затем 100%-ным этанолом (6 раз по 5 мин), 5 мин смесью этанол: ксилол (1:1) и, наконец, ксилолом (2 раза по 5 мин).

7.Заключите препарат под покровное стекло в Fluormount (Gurr, Великобритания).

При использовании данного метода изображение цитоплазмы не мешает наблюдать ядро. Информацию о цитоплазме также можно получить либо отдельно, либо рассматривая общее изображение клетки. Данная методика приготовления препаратов и их окраски [29] была недавно модифицирована и приспособлена для выполнения на центрифуге с откидными стаканчиками [39], но это дало лишь возможность более точной оценки поглощения. Другая методика приготовления мазка клеток шейки матки приведена в табл. 4.20.

5.4.4. Проведение измерений

1.Включите источники света и компьютер, подождите около 20 мин, чтобы лампы стабилизировались. В это время установите полевую диафрагму для падающего света таким образом, чтобы она была открыта немного больше, чем измерительная диафрагма, настроенная на размер большого ядра, а полевую диафрагму под столиком микроскопа полностью откройте. С помощью тест-объекта установите освещение по Кёлеру, как описано в гл. 1.

2.Установите препарат на столик и, используя проходящий свет, найдите лимфоцит. Его ядро и цитоплазма будут давать слабую флуоресценцию. Будьте внимательны: нужно выбрать для измерений такое ядро, которое четко отделяется от других ядер.

3.Установите темновой ток ФЭУ на ноль.

4.Смените объектив на Х6З и установите такой диаметр измерительной диафрагмы, чтобы она как раз окружала изображение ядра. Для измерений следует воспользоваться неавтоматическим режимом постоянного измерения и установить показания прибора на 200 относительных единиц. Повторите эту процедуру измерений

сдругими лимфоцитами несколько раз до тех пор, пока у вас не будут получаться результаты около 200 единиц.

5.С этого момента считываемые показания уже не исправляются. Переключите прибор в автоматический режим с распечаткой выходных данных.

6.Найдите и измерьте 10 лимфоцитов и 10 средних эпителиальных клеток в препарате. Перед каждым измерением объектив Х6З вводится в ход лучей, и измерительная диафрагма устанавливается вручную. Затем нажимается кнопка и регистрируется полученное значение флуоресценции в падающем свете.

7.Найдите ядро эпителиальной клетки, в котором по его виду содержится большое количество ДНК. Для каждого такого ядра измеряйте величину его флуоресценции, как описано в п. 6.

8.Исследуйте все предметное стекло для измерения флуоресценции во всех указанных на этапе 7 клетках.

9.После окончания измерений все результаты распечатывают. 10. Хотя лимфоциты и нормальные эпителиальные клетки являются диплоидными, то есть содержат ДНК в количестве 2С, величина их флуоресценции, получаемая при использовании описанного выше метода, различается. Величина поглощения в отдельных участках, особенно в лимфоцитах, превышает значения 0,1—0,3, которые требуются для соблюдения линейной зависимости флуоресценции от содержания вещества. Было показано, что значения флуоресценции для нормальных эпителиальных клеток в 1,3 раза выше, чем для лимфоцитов. Для того чтобы определить плоидность выбранных клеток, необходимо разделить величину их флуоресценции на половину среднего значения для лимфоцитов, умноженного на 1,3. На основе вычисленных значений диплоидного содержания ДНК можно построить гистограмму. Мы исследовали около 800 образцов из шейки матки и смогли заключить, что все препараты из заметных предраковых очагов или раковых образований содержат клетки с количеством ДНК, большим чем 5С. Такие клетки присутствовали также в 10% образцов, взятых из участков без патологических изменений, или из тех, где имелись только воспалительные изменения. По

127