окисления тетразолий дает окрашенные кристаллы, которые, в случае использования нитросинего производного, имеют синий цвет. Если нужно пометить на одном и том же срезе два антигена, то данная окраска дает хороший контраст с продуктом окрашивания щелочной фосфатазы. Если требуется докрасить клеточные ядра, то необходимо использовать метиловый зеленый.

4.2.4. Галактозидаза

Фермент (5-галактозидаза, выделяемый из Escherichia coli, легко конъюгирует с другими белками. Оптимальный рН для бактериального фермента (7,0—7,5) отличается от оптимального рН для (3-галактозидазы человека (5,0—5,6), так что при использовании правильно подобранного буфера нет необходимости специально блокировать эндогенный фермент. Более того, эндогенный фермент инактивируется при нагревании выше 55 °С, поэтому заключенная в парафин ткань уже не содержит активного фермента.

4.2.5. Ферменты, конъюгированные с антителами В настоящее время некоторые фирмы производят ряд высококачественных препаратов конъюгатов вторых

антител. Если можно приобрести коммерческий препарат, то производить конъюгаты в лабораторных условиях не рекомендуется.

Перед проведением конъюгации фермента с антителом желательно предварительно очистить антитела (разд. 2.4) для того, чтобы избежать мечения посторонних белков, из-за которых, может возникнуть неспецифическое окрашивание.

Существует три общепринятых метода конъюгации, в которых используются глутаровый альдегид, периодат или какой-либо бифункциональный реактив. В первом случае Ig и фермент могут быть непрочно соединены глутаровым альдегидом. Мы успешно используем этот метод для связывания антител с щелочной фосфатазой. Соответствующий протокол приведен в табл. 4.7.

Пероксидаза хрена содержит много углеводных остатков; в результате обработки периодатом альдегидные группы могут образовываться на сахарах, содержащих близко расположенные гидроксильные группы. Альдегидные группы будут реагировать с остатками лизина в молекуле Ig, при этом после восстановления образуются стабильные связи. Несколько лет назад мы регулярно пользовались этим методом, но позднее обнаружили, что другой метод более надежен и дает более стабильные конъюгаты. В нем используется бифункциональный реактив — дисульфид - N - сукцинимидил - 3- (2-пиридилдитио)-пропионат (SDPD), который связывает между собой белки по их лизино-вым остаткам посредством дисульфидных мостиков (методика приведена в табл. 4.8).

Таблица 4.7. Конъюгация щелочной фосфатазы с иммуноглобулинами при помощи глутарового альдегида.

1.Растворить 5 мг щелочной фосфатазы в 1 мл 0,1 М фосфатного буфера, рН 6,8.

2.Провести дважды диализ против 2 литров 0,1 М фосфатного буфера с рН 6,8.

3.Добавить 5 мг иммуноглобулина в 1 мл ФСБ, рН 6,8.

4.Добавить 0,15 мл 0,1%-ного глутарового альдегида.

5.Оставить при комнатной температуре на 3 часа.

6.Дважды провести диализ против 5 литров ФСБ.

7.Хранить при 4 °С.

4.3.Коллоидное золото

В этом методе используются частицы коллоидного золота с адсорбированными на них антителами. Исходно методика была создана для электронной микроскопии, где она обладает тем преимуществом, что можно различить отдельные частицы золота, поскольку они обладают высокой электронной плотностью. Применение различных антител, меченных частицами золота различного диаметра, позволяет одновременно локализовать два или даже три антигена. При использовании в световой микроскопии частицы золота визуализируют с помощью реакции преципитации серебра. Метод, как оказалось, более чувствителен, чем те, в которых применяются ферментные метки.

С тех пор, как мечение коллоидным золотом стало обычно использоваться при непрямом методе, несколько фирм выпускают необходимые реактивы, и лучше всего пользоваться ими. Можно также приобрести препарат стрептавидина, адсорбированного на частицах коллоидного золота. Он может быть использован в сочетании с антителами, конъюгированными с биотином.

Количество белка, адсорбированного на поверхности частиц коллоидного золота, зависит от рН, размеров частиц, концентрации ионов и концентрации белка. Первый из факторов, рН, является критическим, и значение рН должно быть близким к изоэлектрической точке адсорбируемого белка. Методы адсорбции белков на золоте описаны в статье Рота [2, том 2], а также в превосходном буклете, выпущенном фирмой Jatissen Pharmaceutica, где даны детальные прописи для белков разных типов.

Таблица 4.8. Конъюгация пероксидазы с иммуноглобулинами методом SDPD.

78