г) Довести концентрацию раствора лизина до 0,1 М, добавляя 0,1 М фосфатный буфер (рН 7,4).

д) Непосредственно перед использованием смешать одну часть раствора параформальдегида с тремя частями раствора лизина и добавить сухой периодат натрия до концентрации 10 мМ.

Это мягкий фиксатор, который подходит для выявления лабильных антигенов, таких как антиген Н2 в тканях

Антигены, найденные на поверхности лимфоидных клеток, такие как антигены гистосовместимости, а также специфические маркеры субклассов лимфоцитов часто бывают нестабильными. Для сохранения их целостности следует принять определенные меры предосторожности. В качестве примера в табл. 4.4 перечислены необходимые этапы изготовления срезов для окраски лабильных маркеров на поверхности лимфоцитов человека, которая используется в нашей лаборатории.

Необходимо учитывать, что фиксатор может неодинаково действовать на разные эпитопы антигена. Если имеется несколько моноклональных антител к одному и тому же антигену, то для каждого из них оптимальные условия обработки среза должны подбираться отдельно.

Срезы кальцинированной ткани, например метастазировавшей в кость опухоли, обычно перед окраской декальцинируют 5%-ной муравьиной кислотой или 0,5 М ЭДТА. Если антиген выдерживает фиксацию солевым раствором формалина, то он обычно выдерживает и процедуру декальцинации.

Таблица 4.4. Приготовление срезов для окраски на маркеры лимфоцитов

A. Замораживание ткани.

1.Поместить маленький кусочек ткани (максимальный размер 3X3X15 мм) в фиксирующую смесь ОСТ (фирма BDH) на тонкий слой пробки.

2.Заморозить в изопентане, предварительно охлажденном жидким азотом,

3.Хранить ткань вместе с пробковой подложкой в пластиковых ампулах в жидком азоте.

Б. Изготовление срезов.

1.Нарезать срезы толщиной 8 мкм на микротоме, установленном в криостатной камере, и смонтировать срезы на стекла по обычной методике.

2.Высушить срезы при 37 °С в течение 1 часа. В таком виде срезы можно хранить или использовать немедленно.

3.Для хранения срезы обернуть пластиковой пленкой (применяется пленка того же типа, который используется для изготовления «облегающей» упаковки пищевых продуктов). Хранить при —20°С, а перед использованием перенести в условия комнатной температуры и удалить пленку.

B. Фиксация.

1.5 мин в кальций-формоловом фиксаторе (табл. 4.3).

2.Окунуть в охлажденный ацетон.

3.5 мин в хлороформ-ацетоне (50 : 50 объем на объем) при —20 °С.

4.Окунуть в охлажденный ацетон.

5.Дважды отмыть в ФСБ.

3.2.Выявление скрытых антигенов

Иногда обработка срезов фиксированной ткани протеолитическими ферментами «выявляет» считавшиеся разрушенными антигены. Пока не совсем ясен механизм, благодаря которому частичное расщепление белков на срезе приводит к индукции ингибировавшейся ранее реакции одного из белков с антителом. Возможно, что искомый эпитоп не повреждается в результате фиксации, а окружается матриксом из поперечно связанных белков, удаление которых делает его доступным для антител.

Использование протеолитических ферментов вносит в метод дополнительную вариабельность результатов, которую трудно» контролировать. Поэтому мы не можем рекомендовать протеолитические ферменты для постоянного практического применения. Однако в диагностике патологии иногда случается так,что имеющаяся в распоряжении исследователя ткань уже была зафиксирована в формалине и залита в парафин, что не является оптимальным для некоторых антигенов. При таких обстоятельствах не остается ничего другого, как попытаться использовать этот подход. В табл. 4.5 дано описание предлагаемой методики.

Результаты показаны на рис. 4.2, где изображен препарат клеток мозжечка человека, зафиксированный формалином и залитый в парафин, на котором с помощью непрямого метода окрашен глиальный фибриллярный кислый белок. Срез, показанный на рис. 4.2, Б, был предварительно обработан проназой (как описано в табл. 4.5), а на рис. 4.2, Л представлен срез, не подвергавшийся такой обработке. В качестве первых антител использовались антитела поликлональной сыворотки кролика (разведение 1 : 100), полученные Бредли (N. Bradley, Institute of Cancer Research). В качестве вторых антител использовались конъюгированные с

75