для обработки одиночных изображений или для сравнения множества изображений друг с другом. Типичным примером такой операции является отношение изображений, когда одно изображение делится на другое (разд. 3.3.2).
IX. Суперпозиция изображений. Во многих случаях очень полезной оказывается возможность наложения (суперпозиции) одного изображения на другое. Примерами могут служить комбинации псевдоцветного флуоресцентного изображения с соответствующим черно-белым изображением в проходящем свете или объединение двух изображений, соответствующих различным флуоресцентным меткам, с целью понять соотношение между ними.
Очевидно, что для выявления с помощью программируемого цифрового анализатора специфических характеристик изображения может применяться и множество дополнительных процедур.
1.4. Электронное оборудование для видеомикроскопии
Если вы уже выбрали те функции, которые необходимы для нашей исследовательской работы (разд. 1.2), вам следует выбрать подходящий тип оборудования для видеомикроскопии. Обобщенная схема системы для видеомикроскопии представлена на рис. 8.13. Камеры и видеопроцессоры обсуждаются в настоящем разделе, а пояснения относительно вспомогательного оборудования, такого как мониторы к магнитофоны, можно найти в разд. 5.
1.4.1. Камеры и контроллеры камер
Для VEC-микроскопии используются камеры типа «видикон» высокого разрешения, чаще всего Chalnicon, Newvicon или Pasecon. Для работы при низкой освещенности требуются специальные камеры, которые обсуждаются в разд. 1.4.2. Если необходимы специальные спектральные характеристики камер, такие как высокая чувствительность в красном или УФ-диапазоне, или исключительно малая задержка, то другие подходящие для этих целей телекамеры можно приобрести у различных фирм, таких как COHU Inc., Hamamatsu Photonics К. K.r DAGE-MTI Inc. и Zeiss. До недавнего времени видеокамеры на ПЗС-матрице не годились для работы из-за низкого разрешения и низкой чувствительности, но теперь, после усовершенствования их приемников, они могут применяться; они обладают очень малой геометрической дисторсией и более широким динамическим диапазоном, чем телевизионные трубки. При работе в условиях особо низкой освещенности необходимо производить охлаждение матричных ПЗС-камер (разд. 1.4.2).
В тех случаях, когда требуется цифровая обработка изображения, используются исключительно чернобелые камеры (с трубками на 3/4 или на 1 дюйм), поскольку цветные камеры имеют три независимых выхода для красного, зеленого и синего сигналов (RGB-система), и соответственно для них требуются три параллельных видеопроцессора. При выборе камеры обращайте внимание на то, чтобы она могла работать без автоматической подстройки сигнала, поскольку усиление и напряжение смещения должны подаваться на нее вручную (разд. 2.3, этап 5). Только при наличии ручной регулировки вы сможете производить аналоговое усиление изображения.
Неоднородности (перепады) в восприятии света, имеющиеся на мишени камеры, называются тенью. В некоторых камерах высокой чувствительности эти перепады могут достигать 30% между разными участками. Некоторые из коммерчески поставляемых камер имеют шейдинг-корректор («корректор тени»), позволяющий пользователю вводить различные комбинации линейных и параболических сигналов для компенсации неоднородностей. Два примера таких камер и их блоков управления приведены на рис. 8.6. В общем предпочтение следует отдавать таким блокам управления, которые могут использоваться с различными камерами [например, с видиконом, кремниконом с усилением на мишени (SIT) и т. д.].
1.4.2. Телевизионные системы для микроскопии с видеоусилением
Исторически сложилось так, что телекамеры, предназначенные для ввода изображений с низким освещением, разрабатывались на основе различных технологий. По разным причинам большинство этих технологий дало начало двум основным классам высокочувствительных детекторов света: видеокамерам с электроннооптическим усилением и твердотельным (матричным ПЗС) камерам с охлаждаемой мишенью. С потребительской точки зрения два типа детекторов различаются тем, что первый, имея усилитель, позволяет визуализировать динамичные (подвижные) образцы, тогда как второй, будучи детектором интегрирующего типа, при очень низких освещенностях пригоден только для того, чтобы визуализировать очень медленно движущиеся или статичные образцы.
158
Рис. 8 б Блок управления камерой, который может быть использован для аналогового усиления А. Видикон Hamamatsu С 2400 (сзади) и его блок управления (нижний прибор), обладающий возможностями усиления, подачи обратного напряжения и аналоговой шейдинг-коррекции На рисунке видна также обладающая наивысшей чувствительностью камера для подсчета квантов, состоящая из двух последовательных микроканальных пластин, соединенных на выходе с видиконом, характеризующимся малой задержкой (фотография любезно предоставлена фирмой Hamamatsu Photonics К К). Б. Система для аналогового усиления контраста (Zeiss АСЕ System), также позволяющая проводить аналоговое усиление и шейдинг-коррекцию Видеопринтер и фотокамера со специальным монитором высокого разрешения расположены под виброизолирующим столом (фотография любезно предоставлена фирмой Zeiss, ФРГ).
I.Видеокамеры с электроннооптическим усилением. Эти приборы, как видно из их названия, состоят из двух функционально различных компонентов — усилителя изображения и видеокамеры. Усилитель изображения служит для улавливания изображения, увеличения его интенсивности и подачи вторичного изображения на видеокамеру, которая считывает его в обычном формате.
Наиболее обычными камерами для низкой освещенности, используемыми в микроскопии, являются камеры
скремниевым усилителем (SIT-камеры, от англ, silicon intensifier target). В их конструкции усилитель изображения с электростатической фокусировкой соединен с телекамерой, имеющей кремниевую мишень в обычной стеклянной трубке. SIT-камеры могут быть в 100 раз более чувствительными, чем просто камеры с кремниевой мишенью, которые сами по себе считаются чувствительными. Основанные на усилении света SITкамеры обычно дают разрешение в 300—600 линий.
SIT-камеры поставляются также с системой двойного усиления, которая называется ISIT (усиленная кремниевая камера с усилением — intensified silicon intensifier target). В такой камере используется дополнительный усилитель, который с помощью волоконной оптики соединен с фотокатодом SIT-камеры. За счет этой комбинации чувствительность увеличивается по сравнению с SIT-камерой примерно в 20—30 раз, что позволяет работать на уровне, близком к пределу восприятия человеческого глаза. Оба типа камер, SIT и ISIT, имеют многощелочной фотокатод, обладающий чувствительностью в спектральном диапазоне 300—850 нм.
Альтернативной по отношению к SIT/ISIT системой является оптическое сопряжение усилителя изображения с телекамерой. В противоположность SIT большинство усилителей изображения работают с фосфорным окном на выходе, где происходит обращение электронного изображения вновь в оптическое для его подачи в телекамеру. С помощью линз (или волоконной оптики изображение, формирующееся в слое фосфора, фокусируется на входном окне видеокамеры. Основным практическим преимуществом данной разработки является то, что она позволяет выбирать усилители изображения и телекамеры с различными характеристиками, требующимися для разных задач.
Основные различия между усилителями изображения связаны с механизмами их работы и способами усиления. Простейшая конфигурация усилителя — вафельного, или бипланарного, типа. Самыми большими ее преимуществами являются маленькие размеры и отсутствие дисторсии. Лучшие с точки зрения степени усиления и качества изображения усилители получаются за счет введения фокусирующего механизма, основанного на электростатической или электромагнитной системе. Электростатическая фокусировка более компактна, дешева и меньше весит. Для исключительно больших усилений эти трубки могут быть собраны таким образом, чтобы фосфорный выход одной из них был оптически сопряжен с входом фотокатода другой. Такие каскадные усилители при наличии трех—четырех ступеней могут давать усиление яркости до 106 раз.
Большого выигрыша можно также достичь за счет электронного усиления внутри самой трубки [14]. Это становится возможным, если между фотокатодом и фосфорным выходом поместить микроканальную пластину (МКП). Одиночная МКП дает усиление электронного сигнала в 103 раз, а несколько МКП могут быть использованы как мощное усиливающее устройство. Усилители изображения, основанные на МКП, имеют характеристики, близкие к многоступенчатым системам с электростатической фокусировкой, но при этом они более компактны, обладают меньшей дисторсией и не требуют таких мощных источников питания (рис. 8.6, Л).
II.Твердотельные камеры с охлаждаемым детектором. Последние достижения в конструировании
159
твердотельных камер являются очень многообещающими с точки зрения световой микроскопии. Не являясь по конструкции усиливающими, эти камеры позволяют тем не менее получать изображения при низких уровнях освещенности. Обладая высокой квантовой эффективностью (способностью превращать фотоны в электроны), они позволяют достигать высокой чувствительности в первую очередь за счет охлаждения детектора и медленного считывания сигнала. Охлаждение ПЗС-камер (от —25° до —125 °С) приводит к резкому снижению их темнового тока, являющегося компонентом шума. За счет медленного считывания еще больше уменьшается шум, связанный с электроникой, работающей на высоких частотах. Изображения с малой яркостью непосредственно улавливаются микросхемой аналогично тому, как это происходит при длительной фотоэкспозиции. Высококачественные ПЗС-камеры превосходно сохраняют геометрию изображения, имеют высокую фотометрическую точность и большой динамический диапазон, так что они несомненно будут находить все более широкое применение в микроскопии при количественных исследованиях статических образцов.
III. Практические соображения относительно выбора систем камер для условий низкой освещенности. 1. Чувствительность. Ясно, что наиболее важным условием при выборе камеры для условий низкой
освещенности является ее чувствительность. Выпускается широкий спектр камер с различной чувствительностью — от той, которая достаточна только для фазового или дифференциального интерференционного контраста, до такой, которая позволяет работать на уровне отдельных фотонов.
Рис 8 7. А. Диапазон относительной светочувствительности видиконов и камер для низкой освещенности Для сравнения указаны сверхвысокочувствительные фотопленки, которые позволяют вести фотографирование при свете луны и звезд. Система 1, учитывающая отдельные кванты, имеет на выходе фосфорный экран, а система 2— полупроводниковый детектор.
Б, Спектральные характеристики трех наиболее распространенных типов фотокатодов.
В — бищелочной катод, М — многощелочной (S20); S — катод типа S1.
Чувствительность телекамеры определяется обычно путем освещения ее точно известным количеством света от лампы накаливания и измерения выходного тока камеры. Результаты в виде соотношения амперы/люмены выводятся на график в логарифмических координатах как «светопреобразующая характеристика». Такой способ полезен для сравнения различных систем, но может давать неправильные результаты в отношении высокочувствительных камер. Дело в том, что данный метод не позволяет учесть шумовую компоненту внешнего сигнала и при использовании лампы накаливания дает сильный уклон в сторону фотокатодов, чувствительных к красному свету. Шкала типичных чувствительностей для различных
160
высокочувствительных камер приведена на рис. 8.7, А.
2.Спектральная характеристика. Спектральная характеристика камер с усилением определяется материалом, из которого изготовлены их окна, и типом фотокатода. Наиболее обычным является фотокатод многощелочного типа (S20) с наибольшей чувствительностью при 420 нм и достаточной чувствительностью в области до 800 нм. Спектральные характеристики трех обычных фотокатодов — многощелочного, бищелочного и типа S1 — показаны на рис. 8.7, Б. Следует отметить, что повышенная чувствительность катодов типов S20 и S1 в красной части спектра сопровождается повышенными уровнями шума (тепловой шум). Хотя в большинстве случаев это не создает проблем, однако для очень низких уровней освещенности желательно выбрать бищелочной тип фотокатода, если для работы не требуется чувствительности в более широкой области спектра.
3.Разрешение. Как уже отмечалось, обычно высокое разрешение и высокая чувствительность — это две взаимозависимые характеристики. Такая взаимосвязь обусловлена шумом. В высокочувствительных системах шум может быть двоякой природы — зависимый и независимый от сигнала. Последний обычно присутствует в постоянном количестве независимо от наличия света. Он возникает вследствие тепловых шумов усилителя, мишени камеры, видеоусилителя и т. д. При сравнительно большой освещенности шумы относятся в основном
кэтому типу. По мере снижения освещенности начинает доминировать зависимый от сигнала шум. При низких уровнях освещенности фотокатода разрешение в первую очередь лимитируется конечным числом освобождающихся с его поверхности фотоэлектронов — возникает так называемый фотоэлектронный, или квантовый, шум. Именно этот шум приводит к снижению разрешения при уменьшении уровня освещенности. Таким образом, разрешение при слабом освещении нужно определять как функцию интенсивности света, и, если устанавливаются возможные различия между фотокатодами, это желательно делать при определенной длине волны.
4.Задержка. Задержка, или динамическая характеристика, отражает скорость реакции камеры на изменения освещенности. Если вам требуется система для регистрации быстро меняющихся препаратов, то следует выбрать камеру с малой задержкой. В камерах с усилителем задержка обусловлена в основном считыванием сигнала в телекамере, так что применение телекамер с малой задержкой типа Saticon или твердотельных позволяет значительно улучшить эту характеристику.
1.4.3. Компактные цифровые анализаторы изображения
Если требуется цифровая обработка изображения в реальном времени с целью получения картины определенного качества, а дальнейший цифровой анализ в покадровом режиме не нужен (или такая работа планируется с использованием другого оборудования — гл. 7), то за умеренную цену можно приобрести один из многих выпускаемых компактных цифровых видеоанализаторов. При этом следует иметь в виду, что в этих приборах не всегда имеется аналоговое усиление, которое совершенно необходимо для работы с микроскопом. Наиболее подходящие для данных целей процессоры должны обладать возможностями цифрового усиления, вычитания фона в реальном времени с одновременным усреднением кадров плюс дополнительные потенциально полезные возможности. Примерами анализаторов этой группы являются SIGMA II (Hughes Aircraft Co.), DVS 3000 (Hamamatsu Photonics К. К.) или Multicon Leitz (рис. 8.8).
1.4.4. Системы обработки изображения в видеомикроскопии
Существует небольшое число специальных систем, позволяющих проводить все необходимые вычисления в реальном времени и дающих пользователю широкий набор измерительных функций и определенную свободу в манипуляциях с хранящимися в памяти изображениями и в их анализе. В данные системы можно вносить и свое специальное программное обеспечение. Как и приборы предыдущей категории, эти системы обычно содержат блоки управления телекамерой и аналогового усиления. Они могут использоваться с камерами и блоками управления, выпущенными другими фирмами. В них можно вводить и ранее записанные кадры, проигранные с помощью видеомагнитофона. Примерами таких систем являются QX-7 (Qauntex Corporation), ARGUS 100 Hamamatsu (усовершенствованная модель на основе первого разработанного для микроскопа процессора С-1966, который был создан в 1984 году фирмой Hamamatsu совместно с Р. Д. Алленом), Image I/AT (Universal Imaging Corporation), Sapphire (Qauntel) и BioVi-sion (Perceptics Corporation).
1.4.5. Видеопроцессорные платы
Ряд фирм предлагает компьютерные платы для хранения и обработки изображения, которые можно установить на персональные компьютеры типа IBM-AT или системы с VME-шиной. Поскольку это обычно не готовые для непосредственного применения системы, к ним могут требоваться специальные совместимые процессоры. Кроме того, в разработке действующей системы иногда необходимо участие специалиста по программному и техническому обеспечению анализа изображения. Примерами компаний, выпускающих такие платы, являются Datacube Inc., Matrox Electronic Systems Ltd, Data Translation Inc. и Imaging Technology Inc.
161