Галогеновые лампы с вольфрамовой нитью (12 В, 50 и 100 Вт) представляют собой удобный и недорогой источник света при обычных исследованиях в тех случаях, когда препараты дают достаточно высокую интенсивность флуоресценции. Эти источники могут использоваться для освещения препаратов как проходящим, так и падающим светом, их можно легко и часто включать и выключать, не опасаясь повредить лампу [13].

В спектре испускания ртутной лампы есть характерные лишний, например 366, 405, 436, 546 и 578 нм, и, кроме того, имеется сильное свечение между линиями. В области синего света, например, свечение у ртутной лампы значительно ярче, чем у галогеновой. Ртутные лампы рекомендуется применять, если нужен УФ-свет или интенсивное возбуждение [14]. Выпускаются ртутные лампы мощностью 50, 100 и 200 Вт. Следует отметить, что лампа мощностью 100 Вт имеет меньшую дугу,, чем лампы 50 и 200 Вт. Ртутные лампы имеют ограниченный срок эксплуатации (около 200 часов горения) и используются с источниками питания переменного тока, а 100-ваттные лампы могут использоваться с источниками постоянного тока (для измерений).

Для ксеноновых ламп характерен спектр испускания с относительно постоянной интенсивностью от УФ до красного света [13]. Поставляются лампы мощностью 75, 150 и 450 Вт с гарантированной продолжительностью эксплуатации соответственно 400, 1200 и 2000 часов горения. Обращаться с ксеноновыми лампами следует с осторожностью, так как даже холодные лампы находятся под давлением и поэтому при замене и установке лампы надо пользоваться защитными очками. Эти лампы работают с источниками постоянного тока.

И ртутные, и ксеноновые лампы стоят дорого. Их следует поджигать в условиях, когда мало механических вибраций, например ночью, и использовать стабилизатор напряжения для компенсации больших колебаний напряжения в электрической сети. Это позволяет получить более стабильную точку поджига и значительно стабилизировать световой поток для измерений флуоресценции, которые следует производить с использованием источников постоянного тока.

Лазеры позволяют получить монохроматическое излучение очень большой интенсивности и могут, таким образом, служить источником света при флуоресцентной микроскопии в особых случаях [15, 16]. Использование их в обычных исследованиях лимитируется высокой стоимостью и сравнительно коротким периодом эксплуатации. Лазеры могут быть источниками непрерывного или импульсного света; при использовании коротких импульсов возбуждения (от 1 мкс до 1 не) часто можно избежать выцветания флуоресценции. Лазеры применяются в сканирующей флуоресцентной микроскопии [17]—новом типе флуоресцентной микроскопии, который будет обсуждаться в разд. 6.

3.3. Домики для ламп

Лампы высокого давления должны размещаться в прочных: защитных домиках, снабженных отверстиями для охлаждения. Домики должны иметь приспособления для юстировки лампы в двух направлениях и фокусировки коллекторной линзы. В домиках для ламп часто есть держатели для установки поглощающих тепло или красный свет фильтров или отражающих, фильтров. Вместо теплопоглощающих фильтров лучше использовать отражающие тепло или инфракрасный свет зеркала, поскольку последние реже бьются. Эти фильтры всегда должны располагаться ближе к лампе, чем цветные светофильтры, чтобы предотвратить интенсивное поглощение тепла последними. Для того чтобы получить правильное освещение, при их установке совершенно необходимо следовать инструкциям изготовителя.

3.4. Фильтры

Очень важной частью флуоресцентного микроскопа являются фильтры. Их необходимо тщательно подбирать для каждой задачи. Выбор фильтров основывается на спектральных характеристиках и величине Q используемых флуорохромов, а также зависит от применяемого источника света. Фильтры нужны для того, чтобы выделить определенную часть спектра возбуждения или испускания. Характер их действия виден по кривой пропускания.

Выпускаются фильтры разных типов: окрашенные стекла, интерференционные фильтры с полосой пропускания (ВР), интерференционные фильтры, пропускающие свет, длина волны которого меньше, чем указанная на фильтре, или наоборот больше (соответственно SP или LP), а также СДЗ (рис. 6.5).

120

Рис. 6.5. Кривые пропускания (Т) светофильтров типов SP (A); LP (Б) (интерференционных) (В) и светоделительных зеркал (CBS) (Г).

Окрашенные стекла пропускают в большей или меньшей степени свет, соответствующий их собственному цвету, и поглощают дополнительные цвета. Интерференционные фильтры представляют собой стеклянные подложки, на которые нанесены тонкие слои солей металлов. Фильтры обозначаются значками/буквами и цифрами. Значки и буквы обозначают тип фильтра в соответствии с его функциями или характеристиками, а цифры относятся к длине волны; в случае ВР-фильтров цифры обозначают длину волны, соответствующую максимуму пропускания; в случаях LPили SP-фильтров — длину волны, где их пропускание составляет 50% от максимального. Кроме того, для некоторых фильтров ВР-типа указывается ширина полосы пропускания (в нм). Кроме того, фильтры могут обозначаться в соответствии со своим положением в микроскопе (со стороны возбуждения или испускания), так что используемая различными фирмами-изготовителями терминология весьма запутана.

3.4.1. Возбуждающие фильтры

Полосные фильтры пропускают свет только определенной части (полосы) спектра. В качестве полосных все еще используются стеклянные фильтры марки BG (синее стекло) и марки UG (ультрафиолетовое стекло). Они имеют относительно широкие полосы пропускания. Полосные интерференционные фильтры являются более избирательными. Недостатком этих фильтров в прошлом было их небольшое светопропускание (30— 60%). Теперь проблема решена: в настоящее время фильтры ВР-типа имеют пропускание до 90% и очень узкую полосу, которая может использоваться для селективного возбуждения флуорохромов (линейные фильтры). Соответственно фильтры ВР-типа в основном используются в качестве возбуждающих, особенно когда в качестве источника света применяются дуговые ртутные лампы. В зависимости от качества фильтры различаются по цене.

Фильтры SP-типа пропускают более короткие длины волн и эффективно отсекают более длинные волны [18—20]. Эти свойства делают их пригодными для использования в качестве возбуждающих фильтров, особенно в комбинации с фильтрами LP-типа. В таком сочетании они предпочтительнее стеклянных фильтров (например, марки BG), хотя, как правило, не предотвращают проникновения нежелательного возбуждающего света. Фильтры SP-типа, как и все интерференционные фильтры, стоят дорого, но по сравнению с более старыми типами интерференционных ВР-фильтров они имеют очень большое светопропускание.

Стеклянные фильтры, используемые для возбуждения, имеют сравнительно широкую полосу пропускания и идентифицируются по цвету, который они пропускают.

3.4.2. Запирающие фильтры

Фильтры LP-типа пропускают много света в области длинных волн (90% или даже больше) и эффективно отсекают свет тех длин, которые короче указанной на оправе фильтра. В комбинации с SP-фильтром фильтр LP-типа служит эффективным избирательным фильтром для пропускания флуоресценции. Такая комбинация особенно полезна для последовательного наблюдения двухцветной флуоресценции с минимальным перекрыванием. Хотя фильтры LP-типа используются в основном как запирающие, однако в комбинации с SPфильтрами они могут успешно применяться и в качестве возбуждающих. До недавнего времени все LPфильтры были стеклянными, в настоящее время изготавливаются интерференционные фильтры данного типа. Некоторые стеклянные LP-фильтры при очень высоких интенсивностях обнаруживают аутофлуоресценцию, однако при использовании их в качестве запирающих фильтров при обычной флуоресцентной микроскопии данной проблемы не возникает.

3.4.3. Цветные светоделительные зеркала

СДЗ отражает свет тех длин волн, которые короче указанной на зеркале, и пропускает свет с большими длинами волн. Оно располагается под углом 45° к оптической оси и отражает возбуждающий свет в объектив для эпиосвещения, при котором объектив служит конденсором. Вертикальные многоволновые осветители выпускаются со скользящими или вращающимися гнездами для фильтров, позволяющими проводить эпиосвещение при различных полосах длин волн. В табл. 6.2 приведены разнообразные комбинации фильтров

121