представляет собой карту разностей длин оптических путей между деталями препарата или между препаратом и фоном. Поскольку коэффициенты преломления белковых растворов зависят от их концентраций, то изображение в фазово-контрастном микроскопе представляет собой также и карту концентраций или масс белков и других компонентов протопласта. Обратите внимание, что для достижения высокого контраста необходимо, чтобы дифрагированный свет был достаточно отделен от света нулевого порядка на всем оптическом пути, с тем чтобы первый не попал в фазовое кольцо в з. ф. п. объектива.

Таблица 2.4. Иммерсионная рефрактометрия гепатоцитов

А. Иллюстрация изменений показателя преломления и измерение показателя преломления живой амебы.

Приборы и препараты: рефрактометр для сахара; лиофилизированная фракция V бычьего сывороточного альбумина; фазово-контрастный микроскоп с зеленым светофильтром.

1.Приготовьте водные растворы альбумина различной концентрации. Маточный раствор может быть очень вязким, но его можно хранить в замороженном виде примерно 1 неделю.

2.Измерьте с помощью рефрактометра для Сахаров показатель преломления каждого раствора, определяя соответствующий ему процент сахара по сопроводительным таблицам. Помните, что величина показателя преломления зависит от температуры. После каждого измерения необходимо тщательно промывать светоделительную призму. Полученные результаты покажут, что коэффициент преломления линейно зависит от концентрации.

3.Сделайте препарат одиночной амебы и накройте его покровным стеклом.

4.Нанесите с одного края покровного стекла раствор альбумина и протяните его под стеклом с помощью фильтровальной бумаги, приложенной с противоположной стороны стекла. Повторяйте процедуру до тех пор, пока не убедитесь, что амеба плавает в растворе новой концентрации.

5.Пронаблюдайте за изменениями интенсивности различных структур амебы. Обратите внимание, что по мере роста концентрации альбумина амеба становится светлее, затем перестает быть видна, а при высоких концентрациях белка вновь делается видимой, но уже с обратным контрастом.

6.Проведите смену растворов в обратной последовательности, и вы увидите обратную смену картин.

7.Момент, когда амеба становится невидимой, соответствует концентрации альбумина, при которой раствор имеет тот же показатель преломления, что и большинство структур внутри амебы.

8.Заметные изменения произойдут в степени видимости движущихся псевдоподий. Это связано с изменением в них концентрации цитоплазмы.

Б. Клетки крови.

1.Сделайте серию растворов альбумина в 0,7% NaCl и определите их показатель преломления, как указано выше для упражнений с амебой.

2.Поместите в каждый раствор по капле крови, стараясь минимально изменить его концентрацию.

3.Возьмите пять случайно выбранных полей зрения и подсчитайте в каждом количество темных, светлых и нечетко различимых клеток. Сделайте подсчет для каждой концентрации раствора.

4.Сопоставьте результаты с показателями преломления растворов.

5.Сделайте график на бумаге и определите коэффициент преломления клеток.

4.Темнопольная микроскопия

При установке фазового контраста иногда может получиться сильное несоответствие между размерами прозрачного кольца конденсора и фазового кольца в объективе, что дает эффект темного поля, и тогда препарат виден в обратном контрасте. Вы можете попробовать сделать это, установив, например, объектив Х10 и осветительное кольцо для объектива Х100. Достичь эффекта темного поля можно небольшим смещением фокусировки конденсора, так как из него выходят только лучи, близкие к краю, которые фокусируются около фронтальной поверхности конденсора.

Принцип темнопольной микроскопии состоит в том, что свет нулевого порядка дифракции вообще не участвует в формировании изображения.

24