качестве примера приведем метод выявления ионов металлов, присутствующих внутри клеток в очень низких концентрациях. Для этого металлы в первую очередь переводят в форму сульфидов. Сульфиды, даже имеющие окраску, присутствуют в слишком низких концентрациях, чтобы их можно было увидеть. Однако при использовании физических проявителей отложения сульфидов многих металлов катализируют восстановление Ag+ в металлическое серебро. Инкубацию препарата с солями серебра и проявителем можно продолжать до тех пор, пока в препарате не образуется достаточного количества металлического серебра, чтобы его можно было видеть.

II. Негативное окрашивание. Оно используется для выявления профиля поверхности образца и состоит в том, что краситель откладывается на поверхностях содержащихся в препарате структур. Как и при некоторых методах, упомянутых выше, здесь нет сил, обусловливающих взаимодействие красителя с препаратом.

Негативное окрашивание позволяет хорошо выявлять внутри- и межклеточные каналы и канальцы, а также очертания клеток грибов или спирохет.

III. Прижизненное и флуоресцентное окрашивание. Если добавлять красители или флуорохромы к живым клеткам и тканям, то развивающаяся окраска в значительной степени отражает идущие в них физиологические и биохимические процессы. Классическим примером служит картирование распределения макрофагов в теле млекопитающих, выполненное с помощью красителя синего Эванса, который является индикатором фагоцитоза, поскольку накапливается во вторичных лизосомах. В настоящее время для подобных целей широко используются флуоресцентные красители, поскольку увеличение чувствительности, достигаемое при флуоресценции, позволяет понизить концентрации используемых реактивов и уменьшить токсическое действие красителей. Данный подход сейчас часто называют «использование флуоресцентных зондов». Он применяется для решения широкого круга проблем. Например, тест на жизнеспособность культивируемых клеток может быть основан на том, что интактные клетки не поглощают гидрофильные красители, но проницаемы для гидрофобных красителей [разд. 3.2.2 (I), табл. 5.18]. Другой функцией, которую можно тестировать, используя потенциал-зависимые флуорохромы, является нейронная активность в центральной нервной системе.

2. Приготовление и хранение срезов препаратов

2.1. Необходимые характеристики препарата

Для того чтобы препараты можно было просматривать в световой микроскоп, они не должны быть ни слишком тонкими, ни слишком толстыми. Если препараты слишком толстые, избыток деталей может затруднить анализ. Если они слишком тонкие, то может оказаться недостаточным контраст, и соотношение различных компонентов останется неясным. Для большинства работ подходящая толщина биологического материала составляет несколько микрон, что меньше диаметра большинства клеток млекопитающих, но больше, чем размер многих органелл. Для получения таких тонких слоев исходное состояние многих образцов необходимо радикально изменить. В определенных случаях можно просматривать толстые слои, избавляясь от лишней информации с помощью избирательного окрашивания или с помощью специальных оптических методов, например стереоскопии.

Некоторые биологические препараты, например целлюлозные стенки клеток или волосы млекопитающих, исключительно прочны. Однако, большинство живых клеток легко повреждаются, и попытка непосредственно получить с них тонкие срезы приведет » полному нарушению их морфологии. Таким образом, почти все препараты можно исследовать только после проведения определенных стабилизирующих процедур, направленных одновременно на сохранение структуры и химического состава клеток. Такая стабилизация должна не только защищать объект от механического повреждения, но и препятствовать автолизу, заражению микроорганизмами, экстракции и осмотическому повреждению в растворителях, которые используются в процессе приготовления препаратов. Нужные для стабилизации процедуры часто приводят к гибели клеток или применяются для мертвых препаратов. Иногда клетки должны оставаться живыми в процессе наблюдения, и тогда необходимо принимать специальные меры предосторожности, чтобы не повредить их.

Разумеется, требующиеся для микроскопии тонкие слои очень хрупкие и требуют аккуратного обращения как до, так и после окрашивания. Окрашенные слои должны быть обработаны определенным образом для уменьшения выцветания и получения минимального светорассеяния от них в микроскопе.

2.2. Методы приготовления и хранения препаратов

2.2.1. Получение тонких слоев

Методы приготовления тонких слоев включают в себя нанесение капель и приготовление мазков из жидкостей, получение мазков из мягких субстратов, изготовление срезов плотных тканей на микротоме или криостате и измельчение (растирание) особо твердых образцов. Изготовление срезов изредка проводится на нативном материале (который чаще всего отверждают путем замораживания) и наиболее часто на препаратах, предварительно заключенных в твердую среду. Одна из самых распространенных методик состоит в пропитке препарата расплавленным парафином с последующим охлаждением. Более современные методы — это заливка

100

в пластик, когда препарат пропитывают мономером, который затем полимеризуется, образуя твердые блоки. Препараты, из которых можно делать тонкие слои, получают следующим образом. Жидкие препараты

можно отбирать с помощью пипетки или шприца. Если концентрация клеток в жидкости низка, то дополнительно вводится процедура концентрирования их с помощью центрифугирования, фильтрации или осаждения. Для получения клеточного материала с влажных поверхностей можно использовать мазок, а с сухих поверхностей — липкую ленту, которую надо приложить и отнять. Кусочки твердых тканей можно отделить скальпелем или другим лезвием или из них можно взять керн с помощью иглы. Для резки особо твердых блоков их иногда перед микротомией размягчают.

Таблица 5.4. Получение тонких слоев из биологических образцов

Некоторые общие принципы получения тонких слоев с различных биологических образцов приведены в табл. 5.4, а специальные примеры — в табл. 5.5 и 5.6.

2.2.2. Стабилизация окрашенных и неокрашенных препаратов

I. Фиксация и ее заменители. Обычно биологические образцы стабилизируют с помощью фиксации, в результате которой растворимые нативные компоненты клеток и тканей превращаются в нерастворимые производные. Для достижения этого существует множество способов фиксации, начиная от нагревания и кончая применением органических растворителей или реакционно-способных органических либо неорганических соединений. Однако во всех случаях при фиксации имеет место один или несколько из четырех ключевых процессов.

1.Денатурация белков — если ее не произойдет, то большинство клеток растворится в процессе приготовления или окрашивания препарата.

2.Поперечное «сшивание» внутриклеточного содержимого, например белков глутаровым альдегидом или ненасыщенных липидов четырехокисью осмия.

3.Образование нерастворимых комплексов, например между внутриклеточными катионами меди и анионами сульфида.

4.Вещества, которые не изменяются при фиксации, могут быть стабилизированы с помощью сети, образующейся из фиксированных белков или липидов.

Таблица 5.5. Изготовление тонких слоев хорошо диспергированных клеток из препаратов мочи методом отпечатков на фильтрах

1.Поместите нитроцеллюлозный фильтр Millipore™ с диаметром пор 8 мкм в подходящий аппарат и увлажните мембрану физиологическим раствором.

2.Профильтруйте препарат мочи* под отрицательным давлением (15—20 мм рт. ст.) с помощью водоструйного насоса.

3.Снимите фильтр с аппарата для фильтрации и поместите его клетками вниз на покрытое альбумином предметное стекло. Слегка прижмите фильтр, например с помощью промокательницы**.

101

4. Удалите фильтр и перенесите стекло, которое теперь содержит отпечаток клеток, в ванночку с фиксатором — 95%-ным этанолом.

*Если мочу фильтруют не сразу после взятия, то к ней следует добавить протектор, т. е. бактерицидное вещество, например мертиолат, или фиксатор, например разбавленный формалин.

**Можно собрать клетки тем же способом, но используя стекло, только что вынутое из морозильника.

Таким образом, стабилизация содержимого препарата достигается применением такой фиксирующей смеси, которая делает нерастворимыми интересующие вас компоненты. Сохранение морфологии зависит в первую очередь от стабилизации белков. Однако возможности фиксации в определенной степени ограничены. Разумеется, не все вещества можно сохранить в препарате. Например, трудно сохранить в нем насыщенные липиды, низкомолекулярные водорастворимые компоненты, такие как аминокислоты. Другая проблема возникает из-за избыточности фиксации. Ярким примером этого может служить выявление ферментативной активности. Многие белки плохо сохраняются в клетках, если они не денатурированы и не сшиты поперечными связями, но в результате подобной модификации структуры часто подавляется их ферментативная активность.

Таблица 5.6. Получение тонких слоев из твердых препаратов (дерево) с помощью мацерации

1.С помощью скальпеля или бритвенного лезвия настрогайте деревянный препарат на тонкие стружки.

2.Мацерируйте стружки, замачивая их в смеси, содержащей равные объемы 1 М азотной и хромовой кислот, до тех пор пока концы стружек не начнут размочаливаться (В зависимости от типа древесины и размеров кусочка процесс мацерации может занять до 24 часов, однако его можно ускорить, осторожно подогревая раствор).

3.Отмойте препарат от мацерирующего раствора, несколько раз сменяя воду.

4.Разделите волокна, аккуратно раздергивая их иголкой (получающиеся волокна можно окрасить в суспензии).

Для выхода из этой ситуации были предложены два совершенно различных подхода. Первый состоит в том, чтобы уменьшить нежелательные эффекты, сохраняя, по возможности, некоторые преимущества фиксации. Для этого предлагаются компромиссные решения, например уменьшение времени фиксации и снижение температуры фиксатора, проведение фиксации после окраски, проверка возможности применения новых фиксаторов, например паров бензохинона. Другой подход состоит в том, чтобы вообще избежать фиксации. Например, для иммунного окрашивания или гистохимического выявления ферментов используются нефиксированные срезы, получаемые на криостате. Однако при такой подготовке материала теряется значительная часть его содержимого, и если даже нужные структуры сохранились, все же морфология препарата страдает. Потерю макромолекул можно уменьшить или вообще свести на нет путем покрытия криостатных срезов полупроницаемой мембраной или добавления к растворам красителей коллоидных протекторов. Тем не менее, полной стабилизации содержимого и сохранения морфологии, как правило, нельзя достичь одновременно. Поэтому, для того чтобы подобрать наилучшую методику для каждого конкретного вопроса и препарата, нужен эмпирический подход. Разумеется, это не означает, что в такой работе не существует каких-либо общих правил (табл. 5.7).

II. Монтирование окрашенных препаратов. Проблема стабилизации препаратов после окрашивания представляет особую область. Обычно это делается путем заключения препарата в среду с высоким показателем преломления. Такая изоляция от окружающей среды предохраняет его от микроорганизмов и препятствует выцветанию. Более того, высокий показатель преломления среды снижает светорассеяние на границе препарат— воздух, что создает лучшие условия для микроскопических наблюдений. Среды для заключения часто поставляются в виде растворов, которые, высыхая, оставляют препарат заключенным в твердую пленку. Примерами являются раствор полистирена в ксилоле и поливинилового спирта в воде. Другие среды, такие как желатина или глицерол, применяются в виде невысыхающих растворов; иногда для той же цели используется иммерсионное масло. Такой широкий спектр заливочных сред отражает необходимость компромисса между прочностью препарата, с одной стороны, и удобством работы с ним — с другой. Надо иметь возможность выбора для того, чтобы можно было избежать применения тех заливочных сред, которые будут вымывать краситель или реагировать с ним. Так, препараты, окрашенные гидрофильными реактивами типа сульфонированных кислых красителей, заключают в гидрофобные среды типа полистирена, поскольку водный раствор желатины имеет сродство к красителям, что может привести к их экстракции.

Таблица 5.7. Методы стабилизации различных компонентов биологических препаратов

102