длительность окрашивания.

Рис. 9.10. Иммунофлуоресцентное окрашивание кинетохоров с помощью сыворотки больных CREST-синдромом. Вторичное окрашивание ФИТЦ-меченными IgG против человеческих иммуноглобулинов. Дополнительное окрашивание этидиумбромидом, Микрографию любезно предоставил Г, Споварт (G. Spowart).

6. Наблюдение и регистрация сегментов хромосом

Большинство структурных особенностей хромосом, которые можно выявить с помощью дифференциального окрашивания, видны на пределе или близко к пределу разрешения обычной световой микроскопии. Отсюда следует, что для исследования сегментов хромосом необходим хороший микроскоп, снабженный высококачественными объективами и правильно настроенный. Требуется также высококачественная фотонасадка или встроенная фотокамера. Фотографии обычно используются не только для публикации, но и для первичного анализа кариотипа. Как правило, препарат хромосом легче изучать не при наблюдении в микроскоп, а сравнивая и подбирая изображения отдельных хромосом, вырезанные из фотографии, и сопоставляя их с наблюдаемыми непосредственно в микроскопе.

Практические указания относительно настройки микроскопа содержатся в гл. 1 [43], так что нет необходимости повторять эту информацию. Вместо этого, здесь будут рассмотрены специальные аспекты микроскопии, относящиеся к использованию описанных выше методов дифференциального окрашивания. В общем условия наблюдений при работе с поглощающими красителями существенно отличаются от условий работы с флуоресцентными красителями, но одно общее для них требование нужно отметить. Это применение объективов с плоским полем зрения, которые желательно использовать при всех способах визуальных исследований и при фотографировании хромосом. Если применяются другие объективы, то при наведении резкости на центр метафазной пластинки края ее будут не в фокусе. Постоянно наводить на фокус, переводя взгляд с одной хромосомы на другую, очень утомительно и, разумеется, сравнивать хромосомы становится гораздо сложнее, когда только одна из них находится в фокусе в каждый данный момент времени.

6.1. Наблюдение сегментации с помощью поглощающих красителей

В настоящей главе рассматриваются поглощающие красители Гимза и серебро. В идеале для удобных и удовлетворительных исследований хромосомы должны иметь правильную плотность окраски и достаточный контраст, но на практике это достигается не всегда. В некоторых случаях существует возможность вновь окрасить препараты или, в случае серебрения ядрышковых организаторов, дополнительно окрасить их. Однако иногда этого сделать нельзя, или дополнительная окраска не дает требуемого улучшения картины. Таким образом, полезно иметь быстрый метод проверки качества препаратов до их заключения (чтобы их можно было при необходимости вновь окрасить), а также владеть оптическими методами усиления плотности и контраста для неидеальных препаратов.

Поскольку метафазные пластинки могут встречаться на стекле гораздо реже, чем интерфазные ядра, то для поиска пластинок необходимо использовать объектив малого увеличения (х10). Но объектив с малым увеличением не позволяет увидеть сегменты. С помощью объектива Х40 можно обычно увидеть, есть сегментация или нет, однако этого увеличения недостаточно, чтобы оценивать качество препаратов и тем более исследовать их. Даже в случаях тех растений и земноводных, хромосомы которых столь велики, что их можно отчетливо видеть при малом увеличении, анализ сегментации следует все же проводить при максимально возможном разрешении микроскопа, чтобы быть уверенным в том, что никакие детали вы не пропустите. Таким образом, для определения качества препарата обычно нужен масляно-иммерсионный объектив с увеличением Х90 или Х100. Это означает, что если требуется повторная окраска или какая-либо другая дополнительная обработка препарата (например, двойное окрашивание различными методами), то, прежде всего, необходимо тщательно удалить с препарата масло. Для этого нужно поместить препарат в гистологический стаканчик с ксилолом и держать его там до тех пор, пока на стекле не исчезнут видимые следы масла, затем промыть препарат чистым ксилолом и дать ему высохнуть под тягой. Вместо иммерсионных объективов для цитогенетической работы можно рекомендовать объектив Epiplan X80 фирмы Zeiss [32]. Данный сухой объектив имеет короткий рабочий отрезок, и при работе с ним препарат не надо

207

накрывать покровным стеклом.

Контраст изображения дифференциально окрашенных хромосом можно усилить двумя способами: применяя фазовоконтрастную микроскопию либо соответствующие светофильтры. Дифференциальный интерференционный контраст (по Номарскому) для данных целей не подходит, так как при использовании этого метода контраст повышается только в одном направлении, тогда как хромосомы ориентированы в препарате во всех направлениях. Фазовый контраст применяется для улучшения наблюдения R-сегментов, которые иногда бывают довольно бледными. Его можно также применять для наблюдения при серебрении ядрышковых организаторов, когда сами организаторы черные и хорошо видны, а плечи хромосом бледные и видны плохо. Фазовый контраст существенно улучшает условия наблюдения хромосом; посеребренные ядрышковые организаторы выглядят не черными, а яркими объектами на темном фоне. Следует подчеркнуть, что фазовый контраст улучшит изображение только при наличии какой-либо окраски хромосом, пусть даже и бледной. Поскольку среда, в которую заключен препарат, имеет показатель преломления, приближающийся к показателю преломления хромосом, то в случае полного отсутствия окраски метод фазового контраста не позволяет получить изображение.

Хорошо разработан метод применения светофильтров для повышения контраста. Нужный фильтр выбирается просто по признаку того, что полоса пропускания соответствует спектру поглощения красителя. В случае хромосом, окрашенных методом Гимза, максимум поглощения приходится на 550 нм, следовательно рекомендуется зеленый фильтр. В большинстве случаев подходит фильтр с широкой полосой пропускания, но для получения большего контраста можно воспользоваться интерференционным узкополосным фильтром. Использование зеленого фильтра позволяет избежать утомления глаз при долгой работе с хромосомными препаратами [44]. Если окраска по Гимза оказалась слишком плотной, то можно уменьшить контраст изображения и лучше выявить сегменты, применяя красный светофильтр. Однако работать с ним больше нескольких минут очень утомительно, поэтому лучше отмыть препарат от краски и окрасить его вновь с меньшей интенсивностью. При серебрении ядрышковых организаторов плечи хромосом окрашиваются в желтый цвет, и контраст может быть усилен с помощью бледно-синего светофильтра. Темно-синий светофильтр увеличит контраст еще больше, но, как и красный, он очень быстро вызывает утомление глаз.

6.2. Наблюдение сегментации хромосом, окрашенных флуоресцентными красителями

При дифференциальном окрашивании флуоресцентными красителями хромосомы обычно дают сравнительно слабую флуоресценцию, поэтому для работы требуется флуоресцентный микроскоп высокого качества. Имеется подробное описание такого микроскопа ([45]; гл. 6). Необходимыми качествами его являются: максимально возможная эффективность освещения и собирания света флуоресценции, которая достигается при помощи эпиосвещения (свет проходит через объектив) и путем использования объективов с максимально возможным светопропусканием. Такие объективы, изготавливаемые специально для работы с флуоресценцией, можно приобрести у основных фирм — изготовителей микроскопов и ими следует пользоваться всегда, когда это возможно. К сожалению, не всем доступны лучшие из имеющихся микроскопов, но необходимо подчеркнуть, что при использовании флуоресценции качество результатов прямо связано с качеством микроскопа, и некоторые детали могут быть не видны, если применяется недостаточно совершенное оборудование.

Для флуоресцентной микроскопии требуются возбуждающие светофильтры, которые позволяют освещать препарат только светом определенной длины волны (вызывающим флуоресценцию), и запирающие светофильтры, которые отрезают возбуждающий свет и пропускают только свет флуоресценции. При эпиосвещении эти светофильтры применяются в сочетании с дихроичным зеркалом, которое усиливает их эффект. Очевидно, что для получения оптимальных результатов необходимо подбирать систему светофильтров и дихроичное зеркало так, чтобы они как можно лучше соответствовали характеристикам используемого флуорохрома. Применение неправильной комбинации светофильтров может привести к тому, что появится интенсивная неспецифическая флуоресценция, в то время как специфическая флуоресценция, которую надеялись увидеть, не будет различима. В настоящее время большинство фирм — изготовителей микроскопов встраивают дихроичное зеркало, возбуждающий и запирающий светофильтры в единый блок и поставляют большой набор таких блоков, специально рассчитанных на характеристики определенных флуорохромов. Как уже отмечалось, применение несовершенных систем приведет к тому, что некоторые детали препарата будут плохо видны. В табл. 9.4. приведены блоки фильтров, рекомендуемых различными фирмами-изготовителями; к сожалению, в данной области нет единой номенклатуры и блоки фильтров нельзя переставить с одной модели микроскопа на другую.

Серьезной проблемой при флуоресцентной микроскопии всегда является выцветание флуоресценции под действием света. Используемые для окраски хромосом флуорохромы подвержены выцветанию так же, как и все остальные. Выцветание ФИТЦ, как отмечалось выше, может быть замедлено, если применить соответствующую среду для заключения препаратов (разд. 5.6), а флуоресценция ДАФИ становится более стабильной, если препараты перед просмотром оставить на ночь (разд. 5.1). Способов уменьшить выцветание акрихина не существует, поэтому здесь важно использовать микроскоп и особенно объективы с высоким светопропусканием. Последнее очень существенно при фотографировании, когда важно зафиксировать

208

изображение до того, как оно выцветет.

6.3. Фотографирование сегментированных хромосом

Фотографирование сегментированных хромосом требуется для получения фиксированного изображения для публикации и в особенности для детального анализа распределения полос (сегментации). Анализ картин флуоресцентной окраски просто необходимо делать на фотоотпечатках, так как нереально сделать его под микроскопом прежде, чем препарат выцветет. Стандартный способ анализа кариотипа состоит в том, что хромосомы вырезают из фотографии и подбирают попарно; разумеется данный метод равно применим к флуоресцирующим и нефлуоресцирующим хромосомам.

Таблица 9.4. Рекомендуемые наборы светофильтров для наблюдения флуоресценции красителей, описанных в данной главе

Общие принципы фотографирования дифференциально окрашенных хромосом были описаны Дэвидсоном [46]. Первое условие состоит в том, чтобы микроскоп был правильно настроен ([43], и гл. 3). При использовании нового оборудования, независимо от того, применяете вы простейшую ручную или полностью автоматизированную фотокамеру, всегда необходимо отснять пробную пленку. Различные экспозиции устанавливают путем изменения времени выдержки в ручной камере и путем изменения значения чувствительности пленки в автоматической камере. При пробной съемке нужно устанавливать чувствительность как большую, так и меньшую, чем та, что указана изготовителем пленки. В процессе съемки необходимо записывать все данные о напряжении лампы, использованных фильтрах, времени экспозиции, и, конечно, о типе пленки и методе проявления — они пригодятся в дальнейшем.

В общем случае для фотографирования хромосом, дифференциально окрашенных всеми способами (G-, С-, R- и Q-методами) подходит пленка Kodak Technical Pan, проявляемая в соответствии с рекомендациями изготовителя. Однако при слабой флуоресценции данная пленка может быть недостаточно чувствительной, и следует воспользоваться более чувствительной пленкой, типа Kodak Tri-X. Пленки такого типа имеют более крупное зерно и поэтому с точки зрения разрешения мелких деталей они хуже. Тем не менее их использование

— это единственный выход, если необходимо получить изображение слабо флуоресцирующих объектов. Помимо проблемы выцветания флуоресценции, из-за которой нужно использовать высокочувствительные пленки, при слабом свечении объектов, когда требуются длительные экспозиции, возникает еще проблема реципрокного несоответствия. По существу это означает, что чем больше выдержка, тем ниже чувствительность пленки. При очень слабой флуоресценции, таким образом, может оказаться необходимым снизить значение чувствительности пленки до половины или до четверти от той, которая применяется при съемке ярких объектов. Чтобы определить наилучшую для данного препарата экспозицию, лучше всего отснять пробную пленку.

Недавно фирмой Kodak была выпущена новая пленка под названием Т-max, у которой мелкое зерно сочетается с высокой чувствительностью (400 ед. ASA). Данная пленка обладает большими потенциальными возможностями для фотомикрографии и может намного больше подходить для фотографирования слабо флуоресцирующих объектов, чем обычные пленки.

6.4. Специальные методы исследования сегментов хромосом

До сих пор эта глава была посвящена способам получения дифференциально окрашенных хромосом, их непосредственного наблюдения и фотографирования. В данном разделе внимание будет обращено на некоторые другие, в настоящее время не столь широко распространенные методы, которые позволяют получать дополнительную информацию о сегментированных хромосомах. Для данных методов не существует стандартных процедур, поэтому ниже будут рассмотрены только их основные принципы и даны ссылки на источники подробной информации.

6.4.1. Получение профилей сегментов

Полезным способом представления сегментации в хромосомах является получение профилей сегментов, т. е. графическое изображение различий в плотности окраски или в интенсивности флуоресценции по длине хромосом. Такие профили более удобны для проведения сравнений между хромосомами, т. к. они позволяют

209

определять небольшие отличия в рисунках сегментации и являются основой для количественного и автоматического анализа.

Профили сегментации можно получить непосредственно с окрашенных препаратов или, в особенности в случае флуоресцентного окрашивания хромосом, с фотографий. В последнем случае, из-за свойств фотоэмульсии, высота пиков на профилях не будет точно соответствовать интенсивности флуоресценции. Профиль может представлять собой просто линию, которая получается при проведении сканирования вдоль оси хромосомы, либо изображение всей хромосомы может быть оцифровано и представлено для дальнейшей обработки в виде двумерной карты. Первый способ проще, и он часто дает удовлетворительные результаты, но при его использовании учитывается только часть информации, а на результаты сильно влияют даже небольшие отклонения между линией сканирования и осью хромосомы, поэтому теоретически для получения более удовлетворительных результатов лучше использовать полную цифровую карту.

Для получения профилей сегментации применяется разнообразное оборудование. Раньше, несмотря на возможность использования стандартных приборов, для этих целей часто конструировали специальное оборудование, которое приспосабливали для решения конкретной задачи. Оборудование для изучения сегментации хромосом должно давать такое разрешение, которое позволит различить достаточно малое расстояние между соседними измеряемыми точками — близкое к 0,05 мкм [47].

Удовлетворительное качество профилей сегментации было достигнуто в нашей лаборатории при использовании микроденситометра Vickers M85. Его можно подключить к двухкоординатному плоттеру, и создать систему, которая работает следующим образом. Микроденситометр настраивают на наибольшее возможное разрешение, для чего в ход лучей вводится ахроматический масляно-иммерсионный конденсор. Выбранная хромосома ориентируется так, чтобы пятно сканирования перемещалось вдоль ее оси. При этом в качестве оси сканирования может быть выбрана ось X или У. Для получения максимального разрешения следует установить минимальную диафрагму сканирования, которая при использовании объектива ХЮО даст номинальный размер пятна 0,2 мкм. В качестве объектива применяется ахромат с плоским полем зрения («Microplan»). Поскольку измерения проводятся в монохроматическом свете, дополнительная коррекция цветного изображения, даваемая апохроматами, здесь не нужна. Пятно с помощью ручной подачи медленно перемещают вдоль оси хромосомы. Выходной сигнал, величина которого пропорциональна положению пятна, выводится на ось X самописца, а значение плотности в соответствующей точке — на ось У. Типичный пример результатов сканирования представлен на рис. 9.11. При установке в плоскость полевой диафрагмы соответствующего адаптера тот же прибор может использоваться для получения профилей с негативов [48].

Многие из имеющихся в продаже анализаторов изображения несомненно пригодны для получения профилей сегментации хромосом, но при использовании любой системы критическим условием является ее разрешающая способность. В анализаторах изображения ее определяют телекамера, вспомогательное электронное устройство для обработки изображения, а также сам микроскоп. Прежде чем заказывать систему анализа изображения для получения профилей сегментации, будущий пользователь должен внимательно проверить ее возможности применительно к данной задаче. Очень важно знать также, какую обработку изображения можно проводить после того, как профиль получен. Особую ценность представляет возможность сравнения разных хромосом внутри клеток с хранящимися в памяти данными. Для этого система должна позволять уравнивать по длине гомологичные хромосомы из разных клеток, которые могут быть конденсированными в различной степени. Особенно ценным качеством системы является возможность получения профилей с изогнутых хромосом. Поскольку лишь в немногих метафазных пластинках нет изогнутых хромосом, то невозможность провести их анализ является серьезным ограничением. С результатами, которые получаются при использовании совершенного оборудования, можно ознакомиться в работе Пипера

[49].

Рис. 9.11. Профили оптической плотности для отдельных хромосом человека из разных клеток (окрашивание G- методом). Вертикальные линии на всех профилях отмечают положение центромеры.

6.4.2. Отражательная микроскопия

Павловитский с соавторами [50]: описали метод исследования сегментированных хромосом, основанный на использовании отражательной микроскопии в косом падающем свете. Для этого типа микроскопии хромосомы обрабатывают в течение короткого промежутка времени трипсином для удаления покрывающего их слоя белка

210