8. Выбор условий для фотомикрографии
Большую часть того, что требуется для фотомикрографии, можно выбрать из большого разнообразия пленок и проявителей, поступающих в продажу. Данный раздел содержит информацию, помогающую рационально выбрать фотоматериал, с тем чтобы при использовании удовлетворительной фотосистемы основное внимание могло быть уделено самой микроскопии, где собственно и возникают основные трудности.
8.1. Фотографический процесс
Все процессы обработки фотоматериалов, независимо от того, связаны они с получением негативов или отпечатков, цветная это фотография или черно-белая, основаны на специфическом свойстве определенных солей серебра — их светочувствительности. Эти соли — галогениды серебра, как правило, хлорид или бромид. Фотоматериал состоит из эмульсии этих солей в слое желатины, покрывающем прозрачный пластик или бумагу и редко (теперь) стекло. Когда свет падает на кристалл галогенида серебра, то достаточно примерно 10 фотонов, чтобы произошло восстановление с образованием крошечного кристаллика металлического серебра. Образовавшиеся таким образом кристаллы составляют латентное изображение. При обработке слабым восстановителем (который называется проявителем) кристаллы, составляющие скрытое изображение, относительно быстро восстанавливаются в зерно металлического серебра. Чересчур длительная обработка проявителем или засвечивание приводят к полному превращению галогенида в серебро. Через определенный период времени проявитель сливают, и невосстановленный галогенид растворяют с помощью тиосульфата аммония или натрия, который называется фиксажем. Те области, на которые попал свет, благодаря зернам серебра будут черными на прозрачном фоне, таким образом, изображение будет в виде негатива. Позитивный отпечаток получается из негатива в результате дальнейшей обработки тем же способом, позитивные слайды получаются непосредственно с помощью специального процесса обращения.
Цветная пленка реагирует на свет так же, как и черно-белая, но она содержит вещества, превращающиеся в процессе проявления в цветные красители (разд. 8.3).
8.1.1. Чувствительность пленки
Поскольку для появления одного кристалла металлического серебра в кристалле галогенида серебра достаточно около 10 фотонов, то, следовательно, большие кристаллы галогенида уловят достаточно света для образования металлического серебра за более короткое время, чем мелкие. Таким образом, для получения удовлетворительного изображения на пленке, содержащей более крупные кристаллы, потребуется меньшая экспозиция. Используя более привычные для фотографии термины, можно сказать, что крупнозернистая пленка более «чувствительна». Ситуация усложняется при включении в состав эмульсии сенсибилизирующих красителей, которые поглощают свет в более длинноволновых областях и передают его энергию галогенидам серебра, за счет чего расширяется спектральная чувствительность пленки: только синий свет, синий и красный (ортохроматическая пленка) и, наконец, весь видимый диапазон (панхроматическая пленка).
Чувствительность пленки выражается в различных единицах, в настоящей книге будет использоваться стандарт ISO, близкий к ASA. Данная шкала является линейной, т. е. пленка с чувствительностью ISO 100 будет в два раза более чувствительной (для нее требуется половинное количество света) по сравнению с пленкой ISO 50. В настоящее время низкочувствительными считаются пленки с чувствительностью по шкале ISO до 50, средними — от 50 до 200 единиц ISO, а высокочувствительные могут достигать 1600 единиц ISO. Следует понимать, что чувствительность, указываемая фирмой-изготовителем, является только рекомендацией, которой можно следовать в нормальных условиях. Когда вы начинаете новую работу по фотомикрографии, нужно обязательно отснять пробную пленку, устанавливая экспонометрическое устройство на разные значения чувствительности, большие и меньшие, чем номинальные, и тщательно записывая при этом все необходимые условия.
8.1.2. Зернистость
После проявления изображение состоит из зерен, диаметром около 0,5 мкм каждое. Такие зерна видны только в микроскоп, но поскольку они распределены в эмульсии не равномерно, а случайно, то образуют «зернистость», которая часто заметна на чувствительных пленках. Так как разрешение микроскопа само по себе лимитирует конечное увеличение при фотомикрографии, негатив обычно не приходится увеличивать более чем в 5 — 10 раз, так что зернистость пленки редко является серьезным ограничением.
8.1.3. Контрастность
Контраст в фотомикрографии имеет особое значение, поскольку контрастность изображения, получаемого в микроскопе, как правило, ниже, чем при «бытовой» фотографии. За исключением особых случаев, низкочувствительные пленки в целом более контрастны, чем высокочувствительные. Кроме того, контраст зависит от типа используемого проявителя, температуры и времени проявления.
8.2. Черно-белая фотомикрография
Пленки, пригодные для фотомикрографии, выпускаются всеми основными фирмами, производящими
56
фотоматериалы. Обычно для нее подходят низкочувствительные контрастные пленки, такие, как Ilford Pan F и Kodak Panatomic X. Фирмы рекомендуют проявители, использование которых позволяет получить коэффициент контрастности (величина, близкая к старому показателю гамма) около 1,0. Для увеличения контрастности полезно пользоваться проявителями Kodak НС-110 и D19.
Для фотомикрографии весьма удобна техническая пленка Kodak Technical Pan Film 2415, так как ее контраст может варьировать в широких пределах в зависимости от режима проявления. Проявитель НС-110 дает для данной пленки коэффициент контрастности 1,0 — 2,7, а проявитель D19 — до 3,6. Эти пленки выпускаются в виде 35-миллиметровой и формата 120 и могут быть использованы в лаборатории для других целей, например для изготовления слайдов к лекциям или для копирования документов. При использовании специального проявителя Technidol они могут дать относительно низкий контраст (0,5 — 0,75) и поэтому также пригодны для высококачественных графических работ.
В качестве примера попробуйте использовать пленку Kodak Pan Film 2415 в режиме 50 ед. ISO (ASA). Проявите ее проявителем Kodak НС-110 в разведении D (см. инструкции изготовителя) в течение 6 мин при 20 °С.
Для получения более низкого контраста возьмите пленку с чувствительностью 25 ед. и проявите ее жидким проявителем Kodak Technidol в течение 9 мин при 20 °С, а для высокого контраста возьмите пленку с чувствительностью 125 ед. и проявите ее в D 19 в течение 4 мин при 20 °С.
Различия между негативами и отпечатками, полученными этими тремя способами, значительны (рис. 3.6), так что не составит труда выбрать один способ, подходящий конкретно к данным препарату, микроскопу и условиям получения контраста. Промежуточные значения контрастности могут быть получены за счет изменения времени проявления. При этом необходимо иметь в виду, что более продолжительное проявление или использование более энергичного проявителя приведут одновременно к увеличению контраста и чувствительности. Аналогичные результаты могут быть получены при использовании других мелкозернистых пленок.
8.2.1. Использование цветных светофильтров в черно-белой фотомикрографии
Цветные светофильтры могут значительно улучшать черно-белые фотомикрографии несколькими путями. Микроскоп имеет тем большее разрешение, чем короче длина волны используемого света. В соответствии с этим при удалении из освещения, формирующего изображение, длинноволнового света, в особенности красного, разрешение немного улучшается Этого можно достичь, применяя сине-зеленый фильтр, который иногда называют «минус красный». Можно думать, что применение синего, наиболее коротковолнового из видимого диапазона, света даст еще лучшие результаты. В теории это правильно, но на практике — нет. Синий свет виден очень слабо, что затрудняет фокусировку, и, кроме того, большинство объективов микроскопов рассчитано на оптимальные условия работы в середине видимого спектра.
Рис. 3.6. Влияние проявителя на контрастность. Все эти микрографии были получены на пленке Kodak Technical Pan и проявлены, как описано ниже. Условия печати всех микрографий были идентичны. А. Низкий контраст — проявитель
Technidol, 9 мин при 20 °С. Б. Средний контраст — проявитель НС-110, разведение D, 6 мин при 20 °С. В. Высокий контраст — проявитель D-19, 4 мин при 20 °С. Шкала —100 мкм.
57
Линзы никогда не бывают совершенными. Они имеют различные аберрации, многие из которых зависят от длины волны света. Разработчики рассчитывают объективы таким образом, чтобы максимально скомпенсировать сферическую аберрацию для зеленого света, к которому наши глаза наиболее чувствительны; соответственно если длина волны отличается от 550 нм, то качество изображения может ухудшиться.
Ахроматические объективы не скорректированы в отношении аксиальной и латеральной сферической аберрации для всех длин волн, поэтому они дают изображение со слабыми цветными кольцами, которые видны при внимательном наблюдении. Если используется почти монохроматический свет, чего можно достичь применением соответствующих цветных светофильтров, то неполная коррекция объективов становится несущественной. Полуапохроматы (флюоритовые объективы) и апохроматы, которые хорошо исправлены в отношении хроматической аберрации, также могут давать несколько лучшие результаты при применении света малой ширины спектра.
Все-таки основная причина использования цветных светофильтров — это контроль за контрастностью изображений цветных препаратов. Фильтры позволяют изменять уровень серого на пленке, создаваемый различными цветами изображения. Возьмите, например, окрашенный в красный цвет препарат на белом фоне. Если вставить красный светофильтр, то контраст между объектом и фоном понизится — оба они станут красными и на фотомикрографии будут переданы близкими оттенками серого. Наоборот, если вставить синезеленый (или «минус красный») фильтр, то красный объект будет выглядеть темным и высококонтрастным на сине-зеленом фоне, поскольку он не пропускает синих и зеленых лучей (и потому в норме выглядит красным). Итак, светофильтры, близкие по цвету к окраске объекта, будут делать его на черно-белой фотографии более светлым, а светофильтры дополнительных цветов будут делать объект более темным (рис. 3.7). Пары дополнительных цветов приведены в табл. 3.1.
Цветные светофильтры можно приобрести у многих крупных фирм —• изготовителей микроскопов, в некоторые наиболее совершенные микроскопы они вмонтированы. Кроме того, их можно приобрести у фирмы Kodak .(фильтры Wratten) и других фотографических фирм, например Ilford.
Следует правильно определить в оптической системе место, куда нужно поместить светофильтры. Их всегда следует помещать в осветительную часть микроскопа, а не в ту, где формируется изображение, за исключением тех случаев, когда светофильтры очень высококачественные и специально предназначены для размещения за объективом. Многие микроскопы снабжены специальным держателем для светофильтров, расположенным прямо под конденсором, в идеальном месте для их размещения.
Рис. 3.7. Влияние цветных светофильтров на контраст. Препарат, срез желудка лягушки, окрашен Шиффпериодатом и светлым зеленым, сфотографирован на пленку
Kodak Technical Pan и проявлен при среднем контрасте. Изображения на фотографиях очень близки к тем, которые можно наблюдать глазом. А. Светофильтры не использовались. Вершины клеток, интенсивно окрашенные в пурпурный цвет, выглядят несколько темнее остальной части препарата, в которой преобладает зеленый цвет. Б. Красный светофильтр. Пурпурные .области выглядят бесцветными, а окрашенные в зеленый цвет ядра—темными. В. Зеленый светофильтр. Зеленые ядра становятся невидимыми, а пурпурные участки — высококонтрастными. Шкала 50 мкм.
58