1.1. Определение контраста

Контраст есть отношение разности между интенсивностью (степенью освещенности) фона (7ф) и

Так, яркий белый объект на ярко освещенном фоне не будет давать никакого контраста и, следовательно, будет невидим. Не будет заметен и (маленький) темный объект на ярко освещенном фоне. Однако если препарат светлый, а фон черный, то контраст получается очень хороший. Методы получения контраста основываются на взаимодействиях света с веществом, рассмотренных в гл. 1, разд. 2.

2. Светлопольная микроскопия

Инструкции по настройке микроскопа и получению контраста при данном методе приведены в табл. 2.1. Как можно видеть из этапа 4 в разделе Б (табл. 2.1), контрастность улучшается при закрывании диафрагмы конденсора. Есть соблазн делать это во всех случаях, когда контраст недостаточен, но следует помнить, что при использовании узкого пучка света ухудшится разрешение мелких деталей. Если апертура слишком маленькая, то в результате дифракции вокруг мелких структур возникают ложные границы. В этом случае метод непригоден для наблюдения мелких деталей.

При микроскопии в светлом поле отдельные живые клетки или монослои клеток обычно не изменяют световой поток за счет поглощения настолько, чтобы достигалась контрастность изображения. Однако в сочетании с использованием красителей Светлопольная микроскопия является мощным, широко распространенным методом, который может быть еще более усовершенствован за счет применения светофильтров.

Таблица 2.1. Светлопольная микроскопия: установка контраста

A.Установите освещение по Кёлеру, как указано в гл. 1, разд. 1.2. Б. Случай низкого контраста.

1. Замените препарат, который использовался для установки света по Кёлеру, на препарат клеток буккального эпителия (он готовится следующим образом: прикоснитесь к внутренней стороне щеки чистым пальцем или деревянным шпателем, перенесите клетки на чистое предметное стекло в каплю слюны и накройте покровным стеклом) или клеток кожицы лука, как описано в табл. 1.7.

2. Посмотрите на препарат, освещенный по методу Кёлера. Убедитесь, что практически ничего не видно, то есть при данном методе контраст недостаточен для того, чтобы наблюдать неокрашенный биологический материал. Могут быть видны лишь некоторые вертикальные стенки клеток кожицы лука благодаря их способности поглощать свет и в результате образовывать тень.

3. Обратите внимание, что изображение зависит от степени поглощения.

4. Закрывая апертурную диафрагму, обратите внимание на усиление контраста. Критику данного метода смотрите в резюме настоящей главы.

B.Случай высокого контраста.

1.Теперь замените препарат на другой, например, на окрашенный срез кожи [1]. Помните, что для правильного освещения необходимо открыть апертурную диафрагму.

2.В препарате видны ярко окрашенные цветные слои на белом фоне.

3.Обратите внимание на то, что контраст достигается за счет избирательного поглощения света, возникающего в процессе окрашивания (и приготовления срезов), когда процессы жизнедеятельности в препарате прекращены.

4.Для наблюдения контраста, создаваемого различными окрашенными слоями, можно использовать светофильтры соответствующих и дополнительных цветов. Более подробно данный вопрос рассмотрен в разд. 7.2 данной главы и в разд. 8.2.1 гл. 3.

3.Фазовый контраст

Принцип метода. В заднюю фокальную плоскость (з. ф. п.) объектива вводится пластинка, создающая два эффекта: 1) изменение фазы света нулевого порядка дифракции по отношению к другим порядкам (см. гл. 1, разд. 2.5) и 2) снижение интенсивности света нулевого порядка и в результате — уравнивание его с другими порядками. В современных микроскопах пластинка содержит кольцевое отверстие, которое отличается по толщине от остальной части пластинки и покрыто тонким слоем серебра для частичного поглощения светового потока от нулевого максимума.

Для того чтобы свет попадал в фазовое кольцо, в передней фокальной плоскости конденсора, то есть в плоскости, сопряженной с з. ф. п. объектива, устанавливается кольцевое отверстие.

Глядя в фазовый телескоп, который вставляется вместо окуляра и фокусируется на з. ф. п. объектива, эти два кольца нужно подобрать по размерам и совместить как указано в табл. 2.2.

21

Таблица 2.2. Методика установки фазового контраста

1.Проверьте наличие фазово-контрастных объективов и соответствующего конденсора, желательно также иметь вспомогательный телескоп, необходимый для наблюдения з. ф. п. объектива.

2.Рассмотрите препарат буккального эпителия (табл. 2.1), используя освещение по Кёлеру. Обратите внимание на очень низкий контраст при нормальном светлопольном освещении. Некоторое усиление контраста, необходимое для обнаружения клеток, достигается при закрывании диафрагмы конденсора.

3.Найдя клетки, откройте апертурную диафрагму и установите соответствующее кольцо в конденсоре — оно обозначается окрашенной полоской или цифрой на объективе.

4.Сфокусировав телескоп из з. ф. п., совместите изображение освещающей кольцевой диафрагмы и фазового кольца, которое выглядит более темным на общем фоне. Если изображение светлого кольца слишком большое или маленькое или оно расфокусировано, то это значит, что вы неправильно установили свет по Кёлеру или же опустился конденсор. В этом случае установите фокус конденсора. Если размер светлого кольца явно не соответствует темному кольцу, то вы неправильно выбрали кольцо на конденсоре, это необходимо проверить. Теперь вы создали все условия для фазового контраста, за исключением того, что не ввели зеленый светофильтр. Не все им пользуются, однако он желателен, так как сдвиг длины волны 360°/4 рассчитан именно для зеленого света и не вполне соблюдается для белого света, представляющего собой смесь различных длин волн.

5.Замените телескоп на окуляр и проводите наблюдения. Вам может понадобиться увеличить накал лампы осветителя, но следите за тем, чтобы не перекалить ее.

Вы можете сначала настроить микроскоп с помощью контрастного препарата, а затем заменить его на препарат прозрачного слоя клеток, чтобы оставить ту же плоскость фокуса, если толщина предметного стекла та же.

6.Установите объектив высокого разрешения и повторите этапы 1—4. Большинство микроскопов отцентрированы для смены различных объективов и конденсоров, но все же лучше время от времени проверять центровку.

Для работы с фазовым контрастом необходимо проверить наличие соответствующих аксессуаров в вашем микроскопе, кроме того, желательно иметь зеленый светофильтр. Проверьте также регулировочные винты для фазового контраста, которые должны ходить независимо от центровочных винтов конденсора. Если в микроскопе установлено освещение по Кёлеру, то кольцевая пластинка в конденсоре будет находиться в плоскости, сопряженной с фазовой пластинкой з. ф. п. объектива, и если при установке объектива и кольцевой пластинки вы правильно следовали маркировке фирмы-изготовителя, то в з. ф. п, оба кольца будут хорошо перекрываться.

При микроскопии образец всегда рассеивает свет, так что свет, прошедший через образец, имеет меньшую интенсивность, чем тот, который не проходил через него. (Сравните, например, интенсивность нулевого порядка дифракции в присутствии и в отсутствие препарата.) Рассеяние света есть результат его дифракции и преломления, а также отражения и поглощения. В случае прозрачного образца рассеянный свет выходит из препарата с фазовыми сдвигами относительно нулевого максимума. Для монослоя клеток эта разность фаз составляет около четверти длины волны, а не 1/2 длины волны. При таком малом сдвиге фаз интерференция не будет достаточно сильной, чтобы изменение амплитуды было заметным для глаза. Фазово-контрастный микроскоп приводит эти фазовые сдвиги к такому уровню, который может дать различимую интерференционную картину.

Таблица 2.3. Обнаружение разделения дифрагированного и недифрагированного света при фазовоконтрастной микроскопии

1.Установите микроскоп, как указано в табл. 2.2 (этапы 1—4), но замените препарат клеток на дифракционную решетку или тестовую пластинку Аббе, как указано в гл. 1, разд. 2.5.1.

2.Рассмотрите з. ф. п., где вы увидите картину, показанную на рис. 2.1.

3.Заметьте, что нулевой порядок проходит через замедляющее фазовое кольцо, а дифрагированные лучи (имеющие вид множества колец) большей частью не проходят через него. Только малая часть их окружности попадает на фазовое кольцо. В случае если кольцо нулевого порядка не совпадает с фазовым кольцом, отношение его интенсивности к интенсивностям колец дифрагированного света сильно изменяется.

4.Измените центровку и кольцевую диафрагму конденсора и посмотрите, как это повлияет на картину в з. ф. п. объектива и на контраст изображения. Для объектива с небольшим увеличением, например Х10, можно применить большое кольцо конденсора, что позволит получить изображение в полностью перевернутом контрасте, так называемом темном поле, которое будет обсуждаться далее в разд. 4.

22

3.1. Интерпретация фазово-контрастного изображения

Изображение представлено разными интенсивностями серого (до белого) или зеленого (при зеленом светофильтре). При позитивном фазовом контрасте ядра и цитоплазматические гранулы в клетках буккального эпителия выглядят более темными, чем цитоплазма и окружающий фон. Позитивное фазово-контрастное устройство переводит разность длин оптических путей в некоторую разность интенсивностей в изображении таким образом, что большей длине пути соответствует более темное изображение. Длина оптического пути есть расстояние (t), проходимое светом вдоль оси z до глаза, умноженное на показатель преломления (/г) той части препарата, через которую прошел свет. И линейный путь, и показатель преломления могут быть различными в разных участках препарата и фона.

Длина оптического пути (∆) = t X (nп - nс). (2)

В уравнении (2) nп есть показатель преломления препарата, а nс — показатель преломления среды, в которую заключен препарат.

Существуют также негативные системы, в которых ситуация обратная описанной выше, то есть ядро будет выглядеть светлым по сравнению с окружением, где длина оптического пути была меньше. Неясности возникают в тех случаях, когда разность длин оптических путей составляет более 360/4, или этом существенно положение фокуса. Здесь, однако, мы имели дело только с контрастом и достигли достаточно высокого контраста для того, чтобы изображение, иначе невидимое или плохо видимое, стало доступным для глаза или для фотографирования на фотопленку.

Рис. 2.1. Дифракция в фазовоконтрастном микроскопе. А. Препарат — фазовая решетка с периодом примерно 10 мкм. Б. З.ф.п. объектива с апертурой 0,25, в которой виден свет нулевого порядка дифракции (0), накладывающийся на фазовое кольцо, и другие порядки дифрагированного света (1 и 2), которые частично проходят через фазовое кольцо, но в основном располагаются внутри и снаружи от него.

3.2. Дифрагированный свет в фазовом контрасте

Пример, иллюстрирующий результаты удаления дифрагированного света в фазово-контрастном микроскопе, приведен в табл. 2.3 и на рис. 2.1.

3.3. Использование фазового контраста для измерения параметров ядра в клетках (иммерсионная рефрактометрия)

Способность микроскопа преобразовывать разность длин оптического пути в разность интенсивностей позволяет проводить измерения, например определять внутри клеток линейные размеры ядра по оси z, а также его показатель преломления.

Для более подробного обсуждения данной темы см. работу Росса [2]. В табл. 2.4 дана методика измерений образцов. Эти весьма показательные примеры, впервые опубликованные Барером и Джозефом в серии статей [3—5], широко используются в учебных курсах, разработанных Королевским микроскопическим обществом.

Фазово-контрастная микроскопия открыла большие возможности для наблюдения за живыми клетками и стала теперь широко использоваться. Этот метод характеризуется высокой чувствительностью, позволяющей различать 7/360 длины волны. Этот вид микроскопии имеет, однако, существенный недостаток, выражающийся в том, что изображение каждого элемента окружено ярким ореолом. Это затрудняет проведение измерений, особенно когда объекты очень мелкие.

3.4. Интерпретация фазово-контрастных изображений

Изображение в фазово-контрастном микроскопе создается в результате интерференции световых пучков, относительная фаза которых была изменена светособирающим устройством. Таким образом, изображение

23