изотонического раствора, содержащего акридиновый оранжевый в очень низкой концентрации. Освещение проходящим коротковолновым светом по методу темного поля либо падающим светом тех же длин волн давало замечательную картину. Плавающие трипаносомы были окрашены в яркий желто-зеленый цвет, на котором выделялось красное ядро. Эритроциты оказывались очень темными, и чтобы их увидеть, необходимо было наряду с падающим светом использовать слабый проходящий свет. Слишком сильное облучение УФ-светом могло, конечно, вызвать повреждение клеток паразитов, что также может произойти и при высыхании препарата. Современная, без использования лабораторных животных, модификация данной простой методики состоит в том, что берется проба из замороженной культуры трипаносом в среде М199 на солевом растворе Эрла (Flow Laboratories) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, глутамина и антибиотиков — пенициллина и стрептомицина. Акридиновый оранжевый в концентрации 50 мкг/мл в сочетании с 5 мкг/мл этидиумбромида и без него дает, даже при слабом возбуждении, хорошую флуоресценцию живых паразитов (Had-son, устное сообщение).

Более подробно о поглощающих и флуоресцентных красителях можно будет прочесть в гл. 4—6 настоящей книги, посвященных гистохимии, иммуноцитохимии и флуоресценции. Но акцент в них будет сделан на фиксированных препаратах.

Количественное измерение интенсивности окрашивания внутриклеточных структур можно проводить с помощью микроденситометра, как это описано на примере дифференциального окрашивания хромосом в разд. 6.4.1 гл. 9. Измерения флуоресценции меченых антител, которым посвящена гл. 4, рассмотрены и в гл. 6. Количественный анализ различающихся по окраске или по тону участков в препаратах тканей описан в гл. 7. Все это — примеры количественных методов с использованием красителей в биологических исследованиях.

7.2. Использование светофильтров

На срезе животной ткани, например кожи, окрашенной трехцветным методом по Мэсону [1], можно увидеть большой набор цветов, от синего до красного. Очень полезно рассмотреть последовательно одно и то же поле зрения, используя белый, затем синий, затем зеленый, и, наконец, красный свет (табл. 2.16). Участки ткани, окрашенные, например, в красный цвет, будут выглядеть при зеленом освещении темными. Таким образом, контраст повышается при использовании светофильтров дополнительных цветов. В очень сильно окрашенном препарате можно иногда выявить детали, если использовать светофильтр того же цвета, что и краситель. Пользу от применения светофильтров хорошо знают те, кто занимается фотографией и фотомикрографией, но о них часто забывают при визуальных микроскопических наблюдениях (гл. 3 и 8).

7.3. Срезы

С точки зрения световой микроскопии срезы делают для того, чтобы получить четкую картину, по возможности, в одной плоскости. Существует некая минимальная толщина по оси z, начиная с которой все детали изображения будут смазаны за счет структур, лежащих выше и ниже фокуса. На практике в большинстве случаев достигается компромисс между толщиной среза и связанными с ней проблемами, с одной стороны, и контрастом в направлениях х и у, с другой стороны. Детали препарата должны быть достаточной толщины, чтобы связывающийся с ними краситель давал значительное поглощение, а при использовании фазового контраста или DIC-метода достигалась достаточная разность оптических путей. Поэтому, чтобы добиться одних и тех же различий по цвету и тону, более тонкие срезы необходимо красить интенсивнее, чем толстые.

Таблица 2.16. Использование фильтров для получения контраста

1.Используя светлопольную микроскопию, рассмотрите препарат, например хорошо окрашенный гематоксилин-эозином мазок, или срез кожи, окрашенный по Мэйсону для выявления трихомов. Запомните распределение цветов.

2.Повторите наблюдение с зеленым фильтром. Обратите внимание на снижение интенсивности для всех структур, имевших красный цвет, и увеличение контраста между ними и структурами, имевшими голубую окраску.

3.Повторите то же, используя другие фильтры, например, красный и синий. Заметьте, что в одноцветном препарате контраст увеличится, если использовать комплементарный цветной светофильтр, но в случаях, когда препарат слишком толстый или перекрашенный, следует применить светофильтр того же цвета.

Представление о плоскости среза, разумеется, необходимо для того, чтобы понять, как по наблюдаемому изображению описать трехмерную структуру изучаемого препарата. Более подробное изложение данного вопроса приведено в посвященном стереологии разд. 3 гл. 7.

7.4. Качество препарата

Микроскопист должен постоянно заботиться о том, чтобы адекватным образом приготовить препарат для

38