7.Рассчитайте величину хода объекта, вычтя два показания шкалы (в нашем случае 53—49 = 4 деления). Вы получите «видимую глубину» объекта.

8.Рассчитайте реальную толщину объекта, умножив видимую толщину (определенную, как было указано выше) на калибровочный фактор деления шкалы микровинта. Цена деления часто бывает выгравирована на штативе микроскопа вблизи микровинта и равна обычно 0,5 мкм. В нашем примере, таким образом, реальная глубина объекта составляет 4X0,5 = 2 (мкм).

Если на микроскопе нет откалиброванной шкалы микровинта, то величину ее деления можно определить, используя препарат известной глубины или толщины и повторив этапы 1—7 из приведенной выше прописи. Хорошим эталоном для калибровки микроскопа в проходящем свете могут быть микрошарики из латекса (их можно получить от Фаллама (Е. F. Fallam), разд. 6), которые выпускаются в виде водной суспензии и имеют широкий диапазон размеров, от 0,5 до 25 мкм. Для микроскопии в падающем свете хорошим стандартом могут служить стеклянные микрошарики известного размера. Они выпускаются приклеенными на держатель препарата для сканирующего электронного микроскопа и бывают разных размеров, от 50 до 230/240 мкм (поставщик тот же).

2.4. Счетные камеры

Подсчет числа объектов в суспензии (например, эритроцитов или дрожжевых клеток) можно легко произвести с помощью счетной камеры. Это специальное предметное стекло, устроенное таким образом, что в него можно внести определенный объем жидкости, либо это стекло с выемкой, имеющей определенную глубину и точно разделенной по дну на квадраты, которыми обозначаются ячейки определенного объема. Для различных целей выпускается несколько типов специальных счетных камер, в том числе для подсчета клеток крови. Последние часто называют гемоцитометрами. Большинство счетных камер производятся с хорошо полированными оптически плоскими поверхностями и применяются в сочетании со специальными толстыми покровными стеклами (толстые стекла не подвержены деформации, которая может привести к заметным ошибкам в величине объема ячейки). На предметных стеклах камер имеются специальные канавки вокруг счетной площади, которые принимают в себя избыток жидкости в случае переполнения камеры, что важно для получения правильного объема суспензии. При соблюдении всех этих условий объем, приходящийся на сеточку, определяется ее площадью, умноженной на глубину камеры. Простейший тип счетных камер, которые в настоящее время выпускаются (сделанные из пластика или, с гораздо большей точностью, из стекла), — это ячейки Sedgewick Rafter (рис. 7.6,5). Их центральная часть имеет глубину 1 мм и площадь 20X50 мм2. Дно этой площадки разделено на квадраты со стороной 1 мм. Когда камера заполнена жидкостью, сеточка ограничивает аликвоты по 1 мкл, так что подсчитанное среднее число частиц на единицу площади означает их число в одном микролитре жидкости. Ошибки в подсчетах могут возникать вследствие того, что частицы распределены между квадратами камеры неравномерно. Это следует по возможности иметь в виду. Данную ошибку можно, однако, исправить, производя подсчеты в достаточно большом числе квадратов, взятых случайным образом для каждой пробы. Обычно подсчитывают клетки примерно в 20 квадратах, случайным образом выбранных из целой площадки. Из полученных данных с помощью соответствующих формул можно получить среднее значение, ошибку среднего и среднее отклонение. Если проба взята действительно случайным образом и в популяции существует нормальное распределение, то легко определить, какое минимальное число частиц необходимо подсчитать, чтобы получить стандартную ошибку среднего в любых заданных пределах. Стандартная ошибка среднего вычисляется по формуле: SEM=SD/корень квадратный (N), где SEM — это стандартная ошибка среднего, SD — стандартное отклонение, a N — число подсчитанных частиц.

N=(SD/SEM)2/

Если в данном уравнении используется SEM, то в ответе получается минимальное число частиц, которое необходимо подсчитать, чтобы получить доверительный уровень 0,682. Если нужен доверительный уровень 0,954 (который соответствует ±2SEM), тогда в формуле для определения SEM знаменатель необходимо разделить на два.

Для подсчета клеток крови используются специальные счетные камеры — гемоцитометры. В одной из них (усовершенствованный гемоцитометр Нойбауэра) глубина составляет 0,1 мм. В этой камере имеется центральная площадка со сторонами по 3 мм, разделенная на 9 квадратов со стороной 1 мм. Каждый из наружных квадратов в свою очередь разделен на 16 квадратиков со стороной 0,25 мм, а центральный квадрат — на 400 маленьких квадратиков со стороной 0,05 мм (рис. 7.6,А). Тройными линиями выделены 25 групп маленьких квадратиков по 16 в каждой (рис. 7.6,5). Поскольку камера имеет глубину 0,1 мм, объем жидкости над самым маленьким квадратиком составляет 2,5х10-4 мм3. Более подробные инструкции по использованию гемоцитометра приведены в разд. 2.4.2.

138

Рис. 7.6. Сетка гемоцитометра Нойбауэра (Neubauer). А. Вся площадь, используемая для подсчетов. Обратите внимание на центральную, выделенную тройными линиями, группу квадратов, разделенных на более мелкие квадраты. Пять специальных квадратов для подсчета обозначены выгравированной на них буквой Е. Четыре больших квадрата с выгравированной на них буквой L предназначены специально для подсчета лейкоцитов в пробе крови. Б. Один из центральных квадратов (увеличен для того, чтобы были видны ограничивающие его тройные линии). В. Камера Седжвика-Рафтера (Sedge-wick Rafter).

Часто перед подсчетами суспензию частиц приходится разводить, так как концентрированные суспензии содержат слишком много частиц на единицу площади, что затрудняет подсчеты и ведет к ошибкам. Если вы работаете с частицами, то лучше суспендировать их в объеме с целым значением, например в 10 или 100 мл. Если тем не менее вам необходимы дальнейшие разведения, так как частиц слишком много и считать их трудно, то разведения надо делать последовательно, например 10:1, 50:1 или 100:1 и т.д. Подсчеты необходимо проводить в как можно большем числе квадратов и соблюдать определенные правила для подсчета частиц, попадающих на границы между квадратами. Обычно считают частицы, лежащие вверху и слева, и исключают частицы, лежащие внизу и справа. Во всех случаях, когда используются подобные камеры, очень удобен какойлибо ручной счетчик, позволяющий сохранять общие результаты подсчетов.

2.4.1. Техника работы со стандартной счетной камерой

Рекомендуется следующая процедура.

1.Настройте микроскоп, используя освещение по Кёлеру или подходящий метод получения контраста. Подберите увеличение таким образом, чтобы надежно различать частицы.

2.Приготовьте подходящее разведение (например, 1 : 100) жидкого препарата, содержащего частицы.

3.Заполните камеру Седжвика разбавленной суспензией, используя для этого чистую пастеровскую пипетку. Накройте камеру покровным стеклом и плотно прижмите его, чтобы выдавить избыток жидкости в канавки.

4.Установите камеру на столике микроскопа и дайте частицам осесть.

5.Подсчитайте частицы, например в 20 квадратах, содержащих по 1 мкл образца каждый. При подсчете необходимо учитывать частицы, которые перекрывают граничные линии» сверху и слева, и исключать те из них, которые перекрывают граничные линии снизу и справа.

6.Подсчитайте среднее, ошибку среднего и стандартное отклонение для количества частиц в 1 мкл суспензии.

7.Используйте эти данные для того, чтобы определить, сколько частиц нужно подсчитать, исходя из выбранного уровня доверительной вероятности.

8.Подсчитайте, если это оказалось необходимым, частицы в дополнительных квадратиках и вновь вычислите среднее, ошибку среднего и стандартное отклонение.

139

2.4.2. Техника работы с гемоцитометром

1.Разбавьте препарат частиц водой, солевым или другим подходящим раствором, выбрав удобное разведение, например 1: 100 или 1:200.

2.Накройте камеру покровным стеклом и плотно прижмите его. Обычно при этом можно видеть серию интерференционных полос между поверхностью камеры и покровным стеклом. Их наличие указывает на то, что камера заполнена правильно и стекло плотно прилегает к ее поверхности.

3.Приставьте кончик пипетки с разбавленной суспензией к боковой грани покровного стекла и дайте достаточному количеству жидкости вытечь из пипетки и за счет капиллярных сил заполнить счетную камеру.

4.Дайте частицам осесть.

5.Осторожно установите камеру на столик микроскопа и сфокусируйте на нее микроскоп, используя объектив X 10. Затем установите объектив Х40.

6.Подсчитайте частицы не менее чем в 5 группах из 16 малых квадратиков камеры. Для подсчета следует выбрать по одной группе в каждом углу камеры и одну в центре группы квадратов, обведенных тройными линиями (квадраты обозначены буквой Е на рис. 7.6,Л). При подсчетах используйте в каждом случае среднюю из трех линий разметки и учитывайте частицы, касающиеся границ вверху и слева в каждой группе квадратиков, а те, которые перекрывают граничные линии снизу и справа, исключите из подсчета. Подсчеты следует начать в левом верхнем углу группы из 16 квадратиков, затем продолжать, двигаясь вниз через четыре квадратика, затем считать, двигаясь вверх в четырех квадратиках в соседнем ряду, снова вниз и наконец вверх в

четырех правых квадратиках блока.

7.Рассчитайте количество частиц в мм3, исходя из следующего соотношения:

число подсчитанных частиц Х разведение (Р) Х 4000 число наименьших (0,05мм) подсчитанных квадратиков.

Допустим, что общее число частиц составило 525, число наименьших квадратиков было стандартным 5X16 (=80), а разведение было 1 : 200. Таким образом, общее число частиц в мм3 составляет

525 X 200 X 4000 / 80 =5250000.

При подсчете в 5 группах из 16 квадратиков каждая, разведении 1 :200 и глубине камеры 0,1 мм (1/10 мм) можно сделать быстрый расчет. В этом случае площадь, на которой делаются подсчеты, составляет 0,2 мм2 (1/5 мм2). Предположим, что число подсчитанных частиц равняется Р. Тогда число частиц в 1 мм составляет P X 5 X 10 X D. Для разведения 1:200 это дает Р Х 10000 (то есть величину Р с прибавлением четырех нулей). Для разведения 1 : 100 общее число частиц в 1 мм3 составляет Р Х 5000.

3. Измерения площадей, поверхностей и других параметров

Впоследнее десятилетие область применения количественной микроскопии расширилась и включает теперь измерения площадей, размеров, извилистости, степени ориентированности, плотности поверхностей и других топологических характеристик. Эти методы могут использоваться для получения количественных характеристик в двух измерениях (даже в тех случаях, когда сами объекты трехмерны). Те же методы могут использоваться и для того, чтобы, наоборот, взяв двумерное изображение, перенести полученную с него информацию на трехмерную структуру. Последний метод лежит в основе стереологии. Количественная оценка двумерной структуры обычно называется морфометрией. Однако некоторые авторы используют данный термин в более широком смысле, включая в это понятие еще и стереологию. В данной главе мы не будем подробно рассматривать морфометрию и стереологию. Исчерпывающую информацию можно найти в работах Ахерна и Даннилла [2], Элиаса и Хайда [3], Расса [4], Вейбеля [5,6] и Вильямса [7].

Идеальным для количественного анализа будет то изображение, которое получено с предельно тонкого среза. На практике его получить невозможно, однако для многих типов измерений близки к идеалу непрозрачные поверхности, видимые в падающем свете, или спроецированные изображения отчетливо отделенных друг от друга частиц. Если вы имеете дело с изображением толстого среза, то следует учитывать возможность касания или перекрывания структур; если уменьшить толщину среза, то с большой вероятностью части объектов будут срезаны или их контраст окажется недостаточным, чтобы проводить измерения. Для компенсации возможных ошибок существует специальная техника, которая подробно описана в вышеупомянутых работах. Другие проблемы возникают в тех случаях, когда интересующие вас компоненты в ткани или отдельные объекты в матриксе распределены неравномерно или не изотропно. При таком неслучайном (анизотропном) распределении нужно использовать специальные приемы. Их описание выходит за рамки введения в микрометрию, которое дается в настоящей главе.

Вморфометрии и стереологии мы имеем дело с точками, не имеющими размеров, линиями, имеющими одну размерность, площадями, имеющими два измерения, и трехмерными объемами. Если с объекта, имеющего n измерений, делается тонкий срез, то ясно, что результат будет представлен в виде (n—1)-размерного профиля. Так, волокно (которое может рассматриваться как линия) будет иметь вид точки, двумерная поверхность — вид линии, а трехмерное тело — вид поверхности. Принципы стереологии просты, и, хотя в ней имеется по крайней мере две разных системы обозначений, на первом этапе для вас это не будет очевидно. Количественные данные обычно приводятся по отношению к объему, который может быть выражен в метрических единицах (например,

вмм3), и по отношению к какому-то другому объему, например исследуемого органа или его части.

140

Большинство методов морфометрии и стереологии позволяют получить скорее оценки, чем точные ответы. Однако, повторяя подсчеты или испытания, можно довести оценки до любого заранее выбранного уровня точности. Эти методы состоят в подсчете числа точек или пересечений опорных линий с объектом, когда они (точки или линии) несколько раз случайным образом накладываются на изображение объекта. Такое наложение можно делать, применяя окулярную сеточку с подходящим расположением точек или линий. Другой способ состоит в том, что на фотоизображение или проекцию изображения накладывается сетка, нарисованная на прозрачном пластике. Первый способ обычно применяется в световом микроскопе, а наложение прозрачных рамок — для электронномикроскопических отпечатков. Обычно употребляются несколько типов сеток, три из которых приведены на рис. 7.7. Наиболее простой тип — разделенное на квадраты поле (рис. 7.7,Л). Такая сетка подходит для многих целей. Кроме этого, благодаря Вейбелю с соавт. [8] широко используется специальная рамка (рис. 7.7,5), в основе которой лежат равносторонние треугольники. В этой рамке концы линий используются в качестве точек для определения парциальных объемов каких-либо фракций, тогда как сами линии используются для подсчета частоты пересечения мембран при определении плотности мембранных поверхностей. Сетка с изогнутыми линиями (рис. 7.7, В) была предложена Мертцем и используется для того, чтобы уменьшить ошибку, возникающую вследствие анизотропии образца.

Рис. 7.7. Схема трех различных сеток, применяемых в морфометрии и стереологии.

А. Простая сетка.

Б. Сетка Вейбеля (Weibel) с линиями, концы которых служат точками для подсчета.

В. Сетка Мертца (Mertz) с искривленными линиями, служащими для компенсации анизотропии образца

Для измерения сетку накладывают случайным образом на изображение и записывают число точек, попадающих на каждую исследуемую структуру или объект. Затем еще несколько раз производится наложение случайным образом и подсчет. Из полученных данных можно рассчитать исследуемые параметры. На практике при световой микроскопии, чтобы избежать необъективности, лучше всего двигать препарат относительно окулярной сетки. Легче всего это делать с помощью предметного столики с шаговым двигателем, что позволит избежать вольного или невольного отбора полей зрения для измерений. Если делают электронные микрографии, то, чтобы выборка была объективной, их снимают систематически, но случайным образом, начиная с левого верхнего угла сеточки для электронно-микроскопических препаратов.

Наиболее часто проводятся измерения частей площади или объема. Измерения площадей легко выполнимы, и с помощью быстро развивающихся методов стереологии можно теперь устанавливать классы размеров, определять форму частиц, толщину пленок, степень извилистости поверхностей, степень анизотропии и многое другое. Подробные описания этих методов имеются в работах [2—7].

3.1. Принципы определения доли площади и парциального объема

На плоском срезе очень просто определить долю площади, занимаемую данной структурой. Это делается следующим образом: на изображение накладывают сеточку, содержащую дискретные точки (рис. 7.7), а затем подсчитывают число точек, попадающих на интересующие исследователя структуры, а также общее число точек, попадающих на весь объект. Данная работа проделывается несколько раз, результаты подсчетов усредняются, и вычисляется величина, часто называемая «долей площади» (и обозначаемая АA), которая приходится в препарате на интересующие вас объекты. Уже более ста лет назад было показано, что для каждого компонента существует эквивалентность между АA и долей его объема в трехмерной структуре (VV). Данное соотношение существует вне зависимости от того, какую форму имеет и как распределена интересующая вас фракция, важно лишь, чтобы она была распределена в образце случайным образом. Это равенство было

141