поверхности среза, а небольшое количество детергента вводится с целью уменьшить гидрофобные взаимодействия между Ig и белками среза.

В нашей лаборатории при окраске большого числа срезов их помещают для промывки в специальные держатели, которые потряхивают в ванночке для окраски. Если срезов немного, то растворы для промывки наливают в промывочные стаканчики. При промывке стёкла со срезами устанавливают наклонно, так чтобы раствор стекал непосредственно по ним. Срезы необходимо промыть несколько раз, следя за тем, чтобы не смыть их со стекол. Это условие еще раз подчеркивает необходимость высококачественной подготовки срезов.

6.2. Выбор правильного разведения антител

При использовании нового антитела необходимо изготовить некоторое количество срезов с ткани, заведомо содержащей данный антиген. Срезы следует окрасить, используя последовательные разведения, увеличивающиеся в геометрической, но не в арифметической прогрессии (например, двукратные — 1:2, 1:4, 1 : 8 и т. д.). Начинать лучше с широких шагов (например, пятикратных), для того чтобы быстро найти необходимый диапазон разведений, а затем повторить эксперимент уже с двукратными разведениями.

Оптимальным является такое разведение, которое позволяет окрасить препарат с интенсивностью, близкой к максимальной. Некоторые сыворотки в высоких концентрациях могут давать неспецифическое окрашивание. В этих случаях разведение надо подбирать таким образом, чтобы неспецифического окрашивания уже не было, а специфическое сохранялось достаточно интенсивным. При использовании моноклональных антител достичь таких условий не составляет большого труда.

6.3. Флуоресцентные метки

Некоторые фиксаторы (например, глутаральдегид) могут вызывать аутофлуоресценцию тканей. После проведения процедур, описанных в табл. 4.10, покровные стекла следует заключить в водную, нефлуоресцирующую среду типа Hydromaunt (National Diagnostic) или в раствор 9:1 (объем на объем) глицерола в 40%-ном формальдегиде. Можно воспользоваться и другой заливочной средой, как указано ниже.

1.К 3 г чистого для анализа (analitical grade) глицерола добавьте 1,2 г поливинилового спирта (Goshenol фирмы Роlaron) и перемешайте.

2.После того, как поливиниловый спирт и глицерол будут полностью перемешаны, добавьте 3 мл воды, перемешайте и оставьте на 4 часа при комнатной температуре.

3.Добавьте 6 мл 0,1 М буфера Трис-HCl (рН 8,5), и инкубируйте, иногда помешивая, при 50 °С до тех пор, пока поливиниловый спирт не растворится.

6.4. Пероксидаза

Окрашивающиеся в результате пероксидазной реакции вещества часто дают коричневую окраску, которую можно спутать с коричневым пигментом, находящимся в срезе, например с тем, который образуется в эритроцитах после фиксации ткани солевым раствором формалина. Таким образом, прежде чем проводить все последующие реакции, часто необходимо предварительно обесцветить срез. Для этого предметное стекло погружают в перекись водорода (мы используем 7,5%-ный раствор) на 5 мин и затем хорошо промывают в воде. Необходимо проверить, однако, не оказывает ли обесцвечивание нежелательного действия на выявляемый антиген.

6.4.1. Ингибирование эндогенного фермента

Прежде чем наносить антигены на срез, проинкубируйте стекла в течение 5 мин в 2,3%-ной периодной кислоте, промойте водой, сполосните в 0,03%-ном свежеприготовленном растворе боргидрида калия и снова промойте водой. Другой часто используемый метод состоит в том, что стекла погружают на 30 мин в 0,3%-ный раствор Н2О2 в метаноле.

Если в результате этих обработок антиген разрушается, то можно проинкубировать стекла 5 мин в ФСБ с 0,1% фенил-гидразина.

6.4.2. Хромогенные вещества для выявления пероксидазы

Из большого числа веществ, потенциально пригодных для получения окраски при пероксидазной реакции, только около пяти получили широкое распространение в иммуногистохимии. Их описание приведено ниже.

Диаминобензидин (ДАБ) с усилением и без него. Это наиболее часто используемый хромоген. Он дает коричневый осадок, нерастворимый в воде, этаноле и ксилоле. ДАБ предположительно является канцерогеном,

иобращаться с ним следует осторожно.

1.Непосредственно перед использованием растворите 100 мг ДАБ в 100 мл 0,1 М буфера Трис-HCl, рН 7,2.

2.Добавьте 100 мл воды, содержащей 70 мкл 30%-ной Н2О2.

3.Погрузите срезы в раствор на 5 мин, после чего хорошо промойте водой.

4.Докрасьте препарат гемалауном Майера и приклейте покровные стекла заливочной смесью DPX (разд. 6.9). Окраску можно усилить, применяя имидазол или серебро. В первом случае приготовьте перед употреблением раствор ДАБ на 0,01 М имидазоле.

83

Таблица 4.11. Пропись реакции усиления серебром пероксидазно-диаминобензидинового окрашивания

Срез сначала окрашивают, используя подходящий метод с меченными пероксидазой антителами, после чего проводят цветную реакцию с ДАВ. Затем окрашивание может быть усилено с помощью предлагаемого ниже метода.

1.Промойте срезы дистиллированной водой.

2.Погрузите их на 5 мин в 2,5 мМ раствор хлорида золота, рН 2,3. Затем промойте дистиллированной водой.

3.Погрузите срезы на 5 мин в 0,1 М раствор сульфида натрия, рН 7,0. Затем промойте дистиллированной водой.

4.Погрузите срезы на 2—6 мин в раствор реактива серебра (си. ниже). Тщательно промойте дистиллированной водой, оставляя в ней стекла на 10 мин между промывками.

5.Погрузите срезы на 15 мин в 1%-ный (объем на объем) раствор уксусной кислоты, сменив ее один раз в течение этого времени. Промойте срезы водой.

6.Докрасьте гемалауном Майера и заключите.

Реактив серебра

Приготовьте нижеприведенные растворы, разведя каждую из данных навесок в 100 мл бидистиллированной воды.

Добавьте по 1 мл растворов Б1, Б2 и БЗ в 1 мл воды. Внесите 5 мкл 40%-ного (объем на объем) раствора формальдегида. Добавьте при сильном помешивании к данному раствору 4 мл раствора А.

Метод докрашивания (усиления) серебром, используемый в нашей лаборатории, приведен в табл. 4.11. Результаты докрашивания серебром приведены на рис. 4.7, где представлен парафиновый срез прямой кишки после фиксации формалином. Он был окрашен непрямым методом для выявления эмбрионального опухолевого антигена СЕА (от англ, carcino-embryonic antigen). Первыми антителами послужили кроличьи анти-СЕА антитела, полученные в нашей лаборатории и использованные в разведении 1:4000. Вторые антитела и цветное проявление проводились так же, как в случае препарата, показанного на рис. 4.2. Антиген локализован на поверхности и внутри эпителиальных клеток. При данном разведении первых антител окраска получается слабой (рис. 4.2, Л), но после реакции с серебром она становится отчетливо видимой (рис. 4.2, Б).

84