Рис. 4.7. Препарат прямой кишки человека, окрашенный для выявления СЕА-антигена, на котором виден эффект усиления пероксидазной реакции серебром. Шкала 50 мкм

Реагент Хэнкера—Яйта. Он состоит из 1 части р-фенилендиамин-HCl и 1 части (вес на вес) пирокатехола и дает черно-коричневый осадок, нерастворимый в воде, этаноле и ксилоле.

1.Непосредственно перед употреблением растворите 150 мг реагента Хэнкера—Яйта в 100 мл 0,1 М буфера Трис-НС1, рН 7,6 и добавьте 120 мкл 30%-ной Н2О2.

2.Проинкубируйте срезы в течение 15 мин, затем промойте их водой.

3.Докрасьте гемалауном Майера и заключите в DPX.

3-Амино-9-этилкарбазол. Он дает красный осадок, растворимый в этаноле.

1.Растворите 2 мг З-амино-9-этилкарбазола в 0,5 мл диметил-формамида (ДМФ) в стеклянном бюксе.

2.Добавьте 9,5 мл 0,2 М ацетатного буфера, рН 5.

3.Непосредственно перед употреблением добавьте 5 мкг 30%-ной Н2О2 и проинкубируйте срезы в течение

15 мин.

4.Докрасьте гемалауном Майера и заключите в глицериновое желе.

4-Хлор-1-нафтол. Он может использоваться в тех случаях, когда требуется получить синюю окраску. Его осадок растворим в ксилоле. Мы не смогли подобрать к нему подходящей дополнительной окраски ядер, так как метиловый зеленый растворим в воде.

1.Растворите при нагревании до 50 °С 20 мг 4-хлор-1-нафтола в 40 мл 20%-ного метанола в солевом растворе Трис-буфера рН 7,6.

2.Перед использованием добавьте 15 мкл 30%-ной Н2О2 и проинкубируйте срезы в течение 10 мин.

3.Заключите препарат в глицериновое желе.

Тетраметилбензадин. Другой синий краситель, нерастворимый в этаноле и ксилоле.

1.Растворите 5 мг тетраметилбензидина в 2 мл диметилсуль-фоксида.

2.Непосредственно перед употреблением внесите раствор в 50 мл 0,02 М ацетатного буфера, рН 3,3, содержащего 20 мкл 30%-ной Н2О2. Проинкубируйте срезы в течение 15 мин.

3.Докрасьте препарат метиловым зеленым и заключите его в DPX.

6.5. Щелочная фосфатаза

6.5.1. Блокирование эндогенного фермента

Прежде чем нанести первые антитела, погрузите стекла со срезами на 5 мин в 20%-ную уксусную кислоту. Тщательно промойте их водой. Эта обработка позволяет полностью подавить активность эндогенной щелочной фосфатазы, в том числе и кишечной. Если при данной обработке разрушается также и исследуемый антиген, то во всех случаях, за исключением тонкого кишечника, эндогенная щелочная фосфатаза может быть подавлена, если готовить 1 мМ раствор субстрата в левамисоле (концентрацию нужно увеличить до 2 мМ для замороженных срезов или тканей с высоким содержанием щелочной фосфатазы, таких как плацента или почка). Последний способ имеет преимущество, поскольку щелочная фосфатаза, используемая для конъюгирования с

85