1.Растворить 10 мг пероксидазы хрена в 1 мл 0,1 М. фосфатного буфера с 0,1 М NaCl, pH 7,5.

2.Профильтровать через маленькую колонку (15 мм в диаметре, 150 мм длиной) с Sephadex G25 (Pharmacia), уравновесить тем же буфером. Собрать фракцию.

3.Растворить 1,2 мг SDPD в 1 мл этанола.

4.Осторожно помешивая, добавить 250 мкл раствора SDPD к раствору пероксидазы. Оставить при комнатной температуре на 40 мин.

5.Профильтровать через колонку с Sephadex G25, как в пункте 2.

6.Профильтровать 5 мг очищенных с помощью афинной хроматографии антител через колонку с

Sephadex G25, как в пункте 2.

7.Осторожно помешивая раствор антител, добавить 10 мкл раствора SDPD. Оставить на 1 час при комнатной температуре.

8.Профильтровать через колонку с Sephadex G25, уравновешенную 0,1 М ацетатным буфером, содержащим 0,1 М NaCl, 25 мМ дитиотрейтола, рН 4,5. Оставить на 1 час при комнатной температуре.

9.Профильтровать через колонку с Sephadex G25, как на этапе 2 (0,1 М фосфатный буфер, содержащий

0,1 М NaCl, pH 7,5).

10.Смешать растворы антител и пероксидазы. Оставить на ночь пои комнатной температуре.

11.Хранить при 4 °С.

4.4. Выбор метки

Не существует правильного или неправильного выбора метки. Выбор должен определяться особенностями изучаемой ткани. Так например, щелочная фосфатаза будет скорее всего» неудачным выбором, если предполагается исследовать ткань кишки, в которой содержится много этого фермента. Желательно не применять пероксидазу, если ткань содержит большое количество эндогенной пероксидазы или коричневого пигмента (который можно спутать по цвету с обычно применяемым субстратом пероксидазы), особенно в тех случаях, когда на антиген могут влиять процедуры, применяемые для удаления эндогенной пероксидазы или пигмента. Другим немаловажным фактором является доступность меченых реактивов, так как обычно гораздо легче и дешевле купить необходимые реактивы, чем метить антитела в лаборатории. Окончательный выбор зависит от личных симпатий исследователя.

5. Методы окраски

Простейший метод выявления антигена на срезе ткани заключается в применении меченых антител (прямой метод). Однако более распространен так называемый непрямой метод, когда первые антитела не помечены, а метка соединена с другим реактивом, который используется для обнаружения первых антител. Например, если первые антитела — IgG мыши, их можно обнаружить с помощью меченых козьих антител, полученных против IgG мыши (непрямой метод).

Из описанных ниже методов прямой метод дает результаты наиболее быстро. Непрямой метод прост в использовании и вполне приемлем по чувствительности, тогда как методы, основанные на использовании взаимодействия фермент-фермент и конъюгированного с антителами коллоидного золота, являются наиболее чувствительными. Здесь, как и во многих других вопросах, нет единственного «правильного» решения, и выбор часто определяется индивидуальными пристрастиями исследователя.

5.1. Прямой метод

Метка непосредственно связывается с первыми антителами (рис. 4.3,Л). Для этого Ig должен быть хорошо очищен. Преимущество метода в его быстроте — он состоит только из одной стадии. Недостатки его заключаются в том, что он менее чувствителен по сравнению с другими методами, а также в необходимости метить отдельно каждое антитело, что связано с большой работой и часто с потерей ценных реактивов.

Рис. 4.3. Прямой (А) и непрямой (Б) методы визуализации с помощью антитела реакционноспособного участка на срезе ткани:

1 — первое антитело;

2 — меченое второе антитело.

79

5.2. Непрямой метод

Вторые антитела получают к иммуноглобулинам животных того же вида, из которого получены используемые для определения интересующего антигена первые антитела. Срезы инкубируют с первыми антителами, отмывают и затем инкубируют с мечеными вторыми антителами (рис. 4.3,Б).

Основное преимущество данного метода состоит в том, что для целой серии различных первых антител необходим только один препарат меченых вторых антител. Это значительно уменьшает объем работ и, кроме того, позволяет более экономно использовать первые антитела, так как при проведении химической модификации часть реактива всегда теряется. Непрямой метод более чувствителен, чем прямой, поскольку с каждой молекулой первого антитела может реагировать более одной молекулы вторых антител.

Особенно большой чувствительностью обладает вариант непрямого метода, когда вторые антитела адсорбируются на частицах коллоидного золота (разд. 4.3).

5.3. Методы, основанные на взаимодействии фермент—антифермент

Этот вариант непрямого метода используется для повышения чувствительности. В иммуногистохимии в качестве метки часто используется фермент. Для простоты описания предположим, что первые антитела получены из крови кролика. Антитела к ферменту по происхождению также кроличьи. Кроме того, требуются немеченые антитела (например козьи) к IgG кролика.

Как показано на рис. 4.4, срез инкубируют с первыми (кроличьими) антителами, отмывают, затем инкубируют с избытком козьей антикроличьей сыворотки и снова отмывают. Раствор комплекса фермент— антифермент готовят, добавляя к раствору фермента полученную против него кроличью сыворотку. Затем смесь наносят на препарат, а после инкубации и промывки проводят цветную ферментативную реакцию. Поскольку иммуноглобулины представляют собой димеры, они могут реагировать с двумя различными молекулами антигена. Если фермент несет более одного эпитопа, а фермент и антитело находятся в смеси в соответствующих концентрациях, то будет образовываться сеть из поперечно связанных молекул фермента и антитела. Цель применения козьей сыворотки против кроличьих IgG состоит в том, чтобы связать комплексы

фермент—антифермент с первыми антителами.

Преимущество данного метода состоит в его большей чувствительности — количество молекул метки, присоединяющихся к каждой молекуле первого антитела, может увеличиваться. Исключается, кроме того, необходимость ковалентного связывания фермента со вторым антителом. Недостатками являются потребность в дополнительных реактивах (сыворотка, полученная против фермента) и большая продолжительность эксперимента, связанная с появлением в цепочке реакций дополнительных стадий.

Если используемый фермент — пероксидаза хрена, то метод называется РАР (пероксидаза—антитела к пероксидазе); часто применяется также набор АРААР (щелочная фосфатаза — антитела к щелочной фосфатазе).

Рис. 4.4. Метод фермент— антифермент. 1—первое антитело; 2 — второе (связывающее) антитело; 3 — комплекс фермент—антифермент (антитело к ферменту). Заметьте, что первые антитела и антитела к ферменту должны быть получены из животных одного вида

На рис. 4.5 показан препарат человеческого лимфоузла, окрашенный на общий лейкоцитарный антиген с использованием (Л) — непрямого метода со щелочной фосфатазой и (Б) — АРААР-метода. Ткань фиксировали в модифицированном мета-карне и заключали в парафин. Первые антитела были мышиными моноклональными (разведение 1:200). В одном случае в качестве вторых антител (рис. 4.4,Л) использованы кроличьи антитела против мышиной щелочной фосфатазы (разведение 1:200). В другом случае (рис. 4.4, Б) использовали кроличьи антимышиные Ig (разведение 1:20), а затем набор АРААР мыши (разведение 1:100). Реактивы были получены от Dako. Цветную реакцию проводили с помощью быстрого красного TR; препарат докрашивали гемалауном Майера (разд. 6.9.2) и заключали в глицериновое желе (разд. 6.9.3). Окраска показывает, что антитела взаимодействуют с поверхностью лимфоцитов, и из сравнения рисунков А и Б видно, что метод АРААР более

80

чувствителен по сравнению с простым непрямым методом.

Рис. 4.5. Человеческий лимфоузел, окрашенный на общий лейкоцитарный антиген с использованием непрямого метода (А) и АРААР-метода (Б). Шкала — 200 мкм

5.4. Системы с использованием биотин — авидина

Авидин — белок, экстрагируемый из яичного белка, — содержит четыре участка связывания, обладающих высоким сродством к биотину из печени. Биотин можно ковалентно связать с первичными или вторичными антителами, которые затем выявляют, используя меченый авидин (рис. 4.6). Авидин имеет изоэлектрическую точку при рН, близком к 10, и положительно заряжен в нейтральных буферах. Поэтому в ткани он должен предпочтительно связываться с отрицательно заряженными молекулами. Стрептавидин, выделенный из Streptomyces avidinii, также содержит четыре участка связывания с биотипом, но его изоэлектрическая точка близка к 7.

Для мечения фермента лучше не прямо соединять белок с авидином или стрептавидином, а связать его с биотипом и использовать немеченый авидин в качестве мостика. Для увеличения чувствительности эта система может использоваться способом, аналогичным методу фермент—антифермент. Вместо меченого авидина наносится комплекс биотинированный фермент—авидин — так называемый ABC-метод (комплекс авидина со связанной с биотипом пероксидазой). Показано, что этим способом можно получить комплекс больших размеров, чем тот, который получается при использовании метода фермент—антифермент, т. е. достигнуть большей чувствительности.

Рис. 4.6. Биотин—авидиновый метод. 1 — первое антитело; 2 — биотиниро-ванное второе антитело; 3 — меченый авидин.

При использовании авидина или стрептавидина для работы на срезах печени необходимо соблюдать осторожность, учитывая наличие эндогенного биотина в этой ткани.

Метод биотинирования белков представлен в табл. 4.9. Молярное соотношение между биотин-М- гидроксисукцинимидом и белком, необходимое для оптимального мечения последнего, зависит от типа применяемого белка. Детали представленной здесь методики использовались д-ром Вествудом (J. H. Westwood, Institute of Cancer Research) для мечения мышиных моноклональных антител. Результаты показали, что происходит связывание в среднем шести молекул биотина с одной молекулой Ig.

Таблица 4.9. Биотинирование иммуноглобулинов

1.Растворите 150 г биотин-М-гидроксисукцинимида в 15 литрах М-диметил-формамида.

2.Растворите 1 мг Ig в 1 мл ФСБ.

3.Смешайте два раствора и механически встряхивайте их в течение 4 часов при комнатной температуре.

81