час.
Срезы изготавливают, как описано в табл. 4.14. Необходимым условием является абсолютная чистота стекол. На них не должно оставаться даже следов нуклеаз, срезы должны хорошо прилипать к ним, а пробы не должны на них адсорбироваться.
Гибридизация ДНК на срезах описана в табл. 4.15. Экспозиция в течение 8 мин при высокой температуре необходима для денатурации ДНК; экспозиция при более низкой температуре необходима для того, чтобы произошла ренатурация ДНК и ДНК-зонд гибридизовалась с ядерной ДНК.
Методика выявления биотина после гибридизации приведена в табл. 4.16; большое число этапов обусловлено необходимостью повысить чувствительность реакции. Рис. 4.8 иллюстрирует выявление Y- хромосомы в ядрах лимфоцитов из лимфоузла мужчины, Y-хромосомы имеют на фотографии вид черных точек. Ткань была зафиксирована формалином и залита в парафин.
9.2.2. Выявление цитомегаловируса
Зонд для него может быть получен от фирмы Enzo Biochem. Метод, используемый для выявления вирусной ДНК, сходен с тем, который применяется для выявления Y-хромосом, за исключением того, что буфер для гибридизации, предлагаемый фирмой-изготовителем, имеет другой состав (5 частей деионизованного 50%-ного формамида; ФСБ; 2 части 50%-ного декстран сульфата; 1 часть 20-кратного раствора SSC; 2 части ДНК-зонда плюс ДНК-носитель). Время денатурации составляет 10 мин, и гибридизации — 60 мин при комнатной температуре.
На рис. 4.9 представлена фотография ткани человеческого легкого, окрашенного по этой методике. Ткань была получена посмортально, фиксирована формалином и залита в парафин. Вирус выявляется в инфицированных клетках в виде больших черных точек.
Рис. 4.8. Препарат лимфоузла мужчины, окрашенный с помощью гибридизации in situ для выявления Y-хромосомы.
Шкала 8 мкм. Препарат окрашен Паллетом (С. D. Pallett).
10. Цитологические препараты
Для окрашивания цитологических препаратов применяются те же методы, что и для окрашивания срезов. Ключ к получению хороших результатов лежит в способе подготовки клеток. В мазках, приготовленных стандартным способом, на поверхности клеток часто присутствует белок или слизь, которые могут препятствовать хорошему взаимодействию между антигенами и антителами. Нежелательным является также наличие большого количества эритроцитов. Поэтому прежде чем делать мазок или осаждать клетки на стекло центрифугированием, необходимо отмыть клетки и удалить, если требуется, эритроциты.
Методики, используемые в нашей лаборатории для приготовления мазков клеток серозных оболочек, костного мозга и соскоба шейки матки, приведены в табл. 4.17—4.19. Мазки окрашивают затем с помощью антител к эпителиальным антигенам, например эпителиальному мембранному антигену или кератинам. Для работы с более лабильными антигенами данные методики можно модифицировать.
92
Рис. 4.9. Препарат человеческого легкого (постмортальный материал), окрашенный с помощью гибридизации in situ для выявления цитомегаловируса, Шкала 30 мкм. Препарат окрашен Паллетом (С. D. Pallett).
На рис. 4.10 представлена фотография мазка, приготовленного из соскоба шейки матки и окрашенного непрямым методом. В качестве первого использовалось кроличье антитело против эпителиального мембранного антигена в разведении 1:500; вторым антителом служил антикроличий Ig овцы, конъюгированный с щелочной фосфатазой в разведении 1: 100. Оба реагента были получены в нашей лаборатории. Цветная реакция проводилась с помощью быстрого красного TR, докрашивание — гемалауном Майера, покровные стекла приклеивали глицероловым желе. Нормальная клетка чешуйчатого эпителия не окрашена, тогда как в клетке с измененным ядром окрашены как мембрана, так и цитоплазма.
11. Количественная оценка
Количественная оценка результатов иммуногистохимического окрашивания связана с большими трудностями, и в литературе имеется лишь несколько сообщений на эту тему. В настоящее время наилучший подход состоит в том, чтобы приспособить методы, используемые в цитохимии. Для определения средней оптической плотности клетки при длине волны света, попадающей в область линейного поглощения красителя, можно использовать сканирующий и интегрирующий микроденситометр [15]. Определение занимает много времени, поскольку каждую клетку необходимо измерять отдельно. Вероятно, его проще применять на цитологических препаратах, где можно сразу измерить целую клетку.
При проведении количественных измерений необходимо строго контролировать все переменные, включая температуру.
Таблица 4.17. Получение мазков серозных выпотов
А. При небольшом загрязнении красными кровяными клетками.
1.Отцентрифугируйте 'препарат в течение 5 мин при 300 g.
2.Удалите супернатант и рассмотрите осадок.
3.Если он цвета крови, то надо удалить эритроциты (см. ниже).
4.Если осадок относительно свободен от крови, ресуспендируйте его в 20 мл ФСБ и вновь отцентрифугируйте. Повторите промывку.
5.Слейте супернатант и ресуспендируйте клетки в возможно меньшем объеме ФСБ.
6.Нанесите каплю на чистое предметное стекло и сделайте вторым стеклом мазок, как для клеток крови. Немедленно зафиксируйте его 95%-ным спиртом и оставьте в нем не менее, чем на 1 час.
7.Храните препарат в спирте, или нанесите на него карбовакс и храните при —20 °С.
Б. Из окрашенных кровью выпотов.
1.Промойте центрифугированный осадок 20 мл ФСБ и вновь отцентрифугируйте. Удалите супернатант.
2.Размешайте центрифугированный осадок в 5 мл ФСБ.
3.Подслоите под него 10 мл Lymphopiep*.
4.Отцентрифугируйте 20 мин при 300 g.
5.Удалите слой ядерных клеток со ступеньки градиента и перенесите их в чистую центрифужную пробирку.
6.Отцентрифугируйте в течение 20 мин при 300 g и соберите супернатант.
7.Продолжите, начиная с этапа 5, как указано, в А.
* Lymphoprep представляет собой смесь метризоата натрия и фиколла, он выпускается фирмой
Nyegaard и Со.
93
12. Оборудование
Для проведения данных работ помимо стандартного оборудования для получения срезов тканей, окраски срезов и мазков требуется только одно специальное приспособление — поддон для окраски. Конструкция его очень проста. Поддон используется для того, чтобы стекла со срезами лежали горизонтально во влажной атмосфере. Мы используем поддоны размером 36 X Х36 см и глубиной 5 см, разделенные внутри поперечными перегородками высотой 2,5 см. Поддон накрывается крышкой из полиметилметакрилата (Perspex, Lucite) (рис. 4.11). Поддон устанавливается на столе с использованием спиртового уровня, для выравнивания под его углы подкладываются кусочки картона. Стекла с препаратами кладут на поперечные перегородки, и на дно наливают немного воды. При закрытой крышке это гарантирует вам, что растворы антител за время инкубации не испарятся.
Рис. 4.10. Две клетки эпителия шейки матки из поврежденного участка» диагностированного как внутриэпителиальный рак 2-ой стадии. Шкала10 мкм.
В некоторых методиках рекомендуется инкубация при повышенной температуре, поэтому полезно иметь в лаборатории термостат. Чтобы ставить в него препараты, вам может потребоваться поддон меньших размеров. Его легко изготовить из коробки для сэндвичей, которые продаются в большинстве хозяйственных магазинов. Для инкубации при низких температурах поддон можно поместить в холодную комнату.
Необходимое оборудование и методы для приготовления блоков ткани и резки срезов хорошо описаны в пособиях, указанных в списке литературы (например, [16]).
Таблица 4.18. Изготовление мазков из кернов костного мозга
1.С помощью гепаринизированного шприца отберите аспиратором 1—4мл костного мозга и поместите их в центрифужную пробирку объемом 50мл, содержащую 1000 ед. гепарина и 5 мл культуральной среды.
2.Размешайте и доведите объем до 35 мл стерильным раствором.
3.Подслоите 15 мл Lymphoprep (плотностью 1,077) (табл. 4.17).
4.Отцентрифугируйте в течение 20 мин при 400 g.
5.Отберите клеточный слой, перенесите его в чистую центрифужную пробирку и доведите объем с помощью ФСБ до 20 мл.
6.Отцентрифугируйте в течение 15 мин при 400 g.
7.Отберите 10 мл и опять доведите объем стерильным ФСБ до 20 мл.
8.Отцентрифугируйте в течение 5 мин при 400 g.
9.Отберите примерно 0,6 мл, хорошо перемешайте и перенесите в силиконизированную коническую центрифужную пробирку на 1 мл.
10.Отцентрифугируйте.
11.Отберите пипеткой супернатант, оставив объем, примерно равный объему осадка.
12.Аккуратно ресуспендируйте и дезагрегируйте клетки, набирая суспензию примерно 10 раз в пипетку на 20 мкл, установленную на подходящий объем.
13.Сделайте мазок и немедленно зафиксируйте его абсолютным этанолом. Оставьте не менее чем на 30 мин. Храните при —20 °С.
Аналогичный метод может быть использован для получения препарата ядерных клеток из периферической крови.
94
Рис. 4.11. Фотография поддона, использующегося при иммуногистохимическом окрашивании.
Таблица 4.19. Получение мазков из соскобов шейки матки
1.Сделайте соскоб с шейки матки деревянным шпателем.
2.Отломите конец шпателя и погрузите его в 10 мл раствора Cellfix (1 г дитиотрейтола, растворенного в 600 мл ФСБ плюс 400 мл этанола). Слегка поболтайте и выньте шпатель. Клетки могут храниться в таком виде при 4°С.
3.Отцентрифугируйте клетки и промойте их ФСБ.
4.Ресуспендируйте клетки в возможно меньшем объеме ФСБ. Нанесите 10 мкл суспензии на чистое предметное стекло и дайте высохнуть.
5.Храните мазки при —20 °С.
13.Благодарности
Мы благодарны С. Д. Палетту (С. D. Palett) за предоставление окрашенных препаратов, которые использовались для получения фотографий, приведенных на рис. 4.8 и 4.9, а также д-ру Слоану (J. P. Sloane) и д-ру Вествуду (J. W. Westwood) за полезные замечания. Эта работа была субсидирована грантом в рамках объединенной программы Cancer Research Campaign и Medical Research Council.
14. Литература
1.Sternberger, S. S. and De Lellis, R. A. (eds.) (1982) Diagnostic Immunehistochemistry. Masson Publishing USA Inc., New York.
2.Bullock, G. R. and Petrusz, P. (eds) (1982 and 1983) Techniques in Immunocytochemistry. Academic Press, London, Vols 1 and 2.
3.Cuello, А. С. (ed.) (1982) Immunohistochemistry. IBRO Handbook Series, John Wiley and Sons, Chichester, Vol. 3.
4.Polak, I. M. and van Noorden, S. (eds) (1983) Immunocytochemistry. John Wright and Sons, Bristol.
5.Polak, J. M. and van Noorden, S. (1987) An Introduction to Immunocytochemistry: Current Techniques and Problems. R. M. S. Handbook 11,. Oxford University Press, Oxford, 2nd edition.
6.Johnstone, A. and Thorpe, R. (1982) Immunochemistry in Practice. Black-well Scientific, Oxford.
7.Galfre, G., Milstein, C. (1981) In Methods in Enzymology, Langone, J. J. and Vinakis, H. V. (eds), Vol.73,p.3.
8.Dearnaley, D. P., Ormerod, M. G., Sloane, J. P., Lumley, H., Imrie S. F., Jones M., Coombes R. C., Neville A. M. (1981) Br. J. Cancer, 44, 85.
9.Chui, K. Y. (1987) Medical Laboratory Sciences, 44, 3.
10.Holgate, C. S., Jackson, P., Cowen, P. N. and Bird, C. C. (1983) J. Hystochem. Cytochem., 31, 938.
11.Watson, J. D., Tooze, J. and Kurtz, D. T. (1983) Recombinant DNA — A Short Course. Scientific American Books, New York.
12.Burns, J., Chan, V. T. W., Jonasson, J. A., Fleming, K. A., Taylor, S. and McGee, J. O'D. (1986) J. Clin. Pathol., 38, 1085.
13.Liesi, P., J alien, J.-P., Villa, P., Grosveld, F. and Rechard, L. (1986) J. Hystochem. Cytochem., 34, 923.
14.Varndell, I. M., Polak, J. M., Sikri, O. L., Minth, C. D., Bloom, S. R. and Dixon, J. E. (1984) Histochemistry, 81, 597.
15.Campbell, D. A., du Bois, R. M., Butcher, R. G. and Poulter, L. W. (1986) Clin. Exp. Immunol., 65, 165.
16.Bancroft, J. D. and Stevens, A. (eds) (1982) Theory and Practice of Histological Techniques. Churchill Livingstone, Edinburgh, 2nd edition.
95