3.1.2. Освещение падающим светом

Данный тип флуоресцентной микроскопии показан на рис. 6.3. Для фокусировки возбуждающего света на препарат и собирания испускаемого флуоресцирующим препаратом света используется только одна линза — объектив. Для отделения испускаемого света флуоресценции от непоглощенного возбуждающего света используется зеркало специального типа — цветное светоделительное зеркало (СДЗ, иногда называемое дихроичным зеркалом), которое располагается при флуоресцентной микроскопии на пути падающего света над объективом. Эти зеркала имеют специальное интерференционное покрытие, которое отражает на препарат свет, длина волны которого меньше определенного значения, и пропускает более длинноволновый свет флуоресценции в окуляры. Более того, возбуждающий свет, отраженный от препарата или от оптических деталей микроскопа и идущий в окуляры, эффективно отражается СДЗ и не попадает, таким образом, в окуляры. В принципе СДЗ работает и как возбуждающий, и как запирающий фильтр, но на практике нужен дополнительный запирающий фильтр для того, чтобы удалить остатки возбуждающего света. На рис. 6.4 приведен пример разделения синего (460 нм) и зеленого (530 нм) света. Существуют аналогичные СДЗ для разделения в других частях спектра, от ультрафиолета (300 нм) до дальнего красного света (700 нм).

Рис. 6.4. Разделение возбуждающего света и света флуоресценции при работе в падающем свете. СДЗ (светоделительное зеркало)

располагается под углом 45° к ходу лучей, оно отражает синий (нужный) возбуждающий свет на препарат и пропускает зеленый свет флуоресценции от него в окуляры. Синий (нежелательный) возбуждающий свет частично отражается обратно в направлении источника света и только небольшая часть его пропускается в сторону окуляров [5].

Преимуществом зпиосвещения является то, что одна и та же система работает и как конденсор, и как объектив. Таким образом, фокусируя данный объектив на препарате, вы одновременно получаете правильную настройку всей данной части микроскопа. Освещаемое поле является полем зрения. При использовании масляно-иммерсионного объектива достаточно нанести масло на препарат, тогда как при работе в проходящем свете для получения максимальной интенсивности освещения необходимо еще нанести масло на высокоапертурный конденсор. Кроме того, эпиосвещение позволяет легко переходить от флуоресцентной микроскопии к микроскопии в проходящем свете, так как нижнее освещение остается легкодоступным. Последнее обстоятельство в ряде случаев имеет большое значение, например при использовании иммунофлуоресценции в сочетании с фазово-контрастной микроскопией.

3.2. Источники света

Выбор источников света определяется спектром возбуждения флуорохрома и квантовым выходом. Для слабых флуоро-хромов с низкой Q требуется больше света, чем для сильных флуорохромов. Некоторые источники света [ртутные (Hg) лампы] характеризуются крутыми пиками испускания в диапазоне 300—700 нм. Для других ламп, например вольфрамовых и ксеноновых (Хе), характерны менее отчетливые пики в данной области. Галогеновые лампы демонстрируют увеличение испускания по мере увеличения длины волны, а ксеноновые лампы имеют отчетливые пики в дальней красной и инфракрасной областях спектра (табл. 6.1).

Таблица 6.1. Лампы, применяемые во флуоресцентной микроскопии

119