2.2.3. Приготовление препарата должно быть ориентировано на решение конкретной проблемы

Если перед вами стоит задача гистохимически исследовать биологический материал, то сразу возникает вопрос о выборе подходящего метода подготовки препарата. При этом необходимо одновременно принимать во внимание три вещи: 1) природу препарата; .2) доступные технические методы; 3) вид информации о препарате, которую желательно получить. Необходимость такой троякой направленности можно проиллюстрировать на примере некоторых типичных условий и дилемм, возникающих в связи с приготовлением препаратов. Если основным условием является сохранение морфологии, то необходимо заливать материал и делать с него срезы. Если же необходимо выявить ферментативную активность, то следует избегать фиксации, а также заливки с применением высоких температур и гидрофобных растворов. Однако обе задачи — выявление ферментативной активности и морфологии — могут быть доставлены одновременно. В такой ситуации одним из возможных подходов является короткая фиксация с последующей заливкой в водорастворимую среду типа гликольметакрилата и отверждением ее при низкой температуре. Однако для этого нужен микротом, на котором можно делать срезы с пластика, и сравнительно дорогой раствор пластмассы. Кроме того, сохранность исходного образца не всегда можно проконтролировать. Например, центральная лаборатория патологической гистологии может получать биопсийный материал из многих периферийных больниц. Этот материал обычно фиксирован нейтральным формалином. Получение препаратов в любом другом виде затруднительно или вовсе невозможно: хирургический персонал имеет свои собственные клинические приоритеты, и живот пациента должен быть благополучно зашит как можно быстрее. Тем не менее мы можем предложить некоторые обобщения, касающиеся методов получения препаратов (табл. 5.8).

3. Что можно выявлять? Некоторые примеры

3.1. Выявление химических свойств

3.1.1. Химические фрагменты

С помощью гистохимии можно выявить широкий спектр химических фрагментов: органические радикалы, такие, как аминогруппы, двойные углеродные связи, тиоловые группы, которые замещают какие-либо группы в молекулах биополимеров или являются составной частью мелких молекул. Этими методами выявляются также неорганические ионы, например анионы фосфата или сульфата, катионы кальция или железа, присутствующие как часть неорганических отложений (например, в кости) или связанные с органическими лигандами.

Иногда химические фрагменты представляют биологический интерес сами по себе, например отложения кальция при формировании кости или вследствие патологической кальцификации поврежденных тканей. В других случаях химические фрагменты используются в качестве гистохимических маркеров. Так, в тканях часто выявляются альдегидные группы, хотя обычно концентрация их невелика. Тем не менее можно индуцировать образование альдегидов из таких компонентов ткани, как ДНК или полисахариды. Последующее выявление альдегидных групп позволяет определить эти исходные соединения. Выявление альдегидных групп. Предлагаемый ниже метод основан на использовании традиционного реактива Шиффа. Этот реактив взаимодействует с альдегидами благодаря своей реакционноспособной ариламиногруппе; богатые альдегидами участки окрашиваются в пурпурный цвет благодаря тому, что в процессе реакции образуется хромофор

103

трифенилметан.

Таблица 5.8. Некоторые технические приемы получения препаратов для решения специальных задач

Методика выявления альдегидов приведена в табл. 5.9. Приготовление реактива Шиффа из широко доступного основного фуксина описано в табл. 5.10. Хотя реактив Шиффа и поступает в продажу, многие исследователи по-прежнему предпочитают готовить его самостоятельно. Способы избирательного образования альдегидных групп в различных биополимерах описаны в табл. 5.11. Вместе табл. 5.9 и 5.11 дают описание стандартного гистохимического метода определения ДНК и классов полисахаридов. В сносках указано, что для оптимального окрашивания необходимо уточнить условия проведения реакции соответственно конкретным особенностям приготовления препарата.

Таблица 5.9. Метод выявления альдегидных групп

1.Распарафинируйте срезы, зафиксированные, например, формалином, и перенесите их в воду. Криостатные или пластиковые срезы также поместите в воду.

2.Поместите препараты в реактив Шиффа, изготовленный, как указано в табл. 5.10, на 15 мин.

3.Промойте проточной водой в течение 5—10 мин*.

4.Промойте 100%-ным этанолом, затем подержите в ксилоле и заключите в синтетическую смолу.

Результат: богатые альдегидными группами участки окрасятся в пурпурный цвет.

Контроль: Окрасьте препарат, заведомо богатый альдегидами, — он послужит положительным контролем. Для этой цели подойдут богатые гликогеном срезы печени. В гликогене альдегидные группы образуются в результате окисления его периодатом; в ДНК альдегидные группы образуются в результате кислотного гидролиза.

Возможные трудности: если контроль не окрашивается, то замените реактив Шиффа. Если опытные срезы не окрашиваются, то прежде чем давать отрицательное заключение, попробуйте увеличить продолжительность обработки на этапах 2 и 3.

* Оптимальная продолжительность окрашивания варьирует в зависимости от применяемых реактивов, способов фиксации и заливки материала.

Таблица 5.10. Приготовление реактива Шиффа

1.Растворите 1 г основного фуксина (парарозанилина или «нового фуксина») в 200 мл кипящей воды.

2.Охладите раствор до 50 °С, добавьте и растворите 2 г метабисульфата калия или натрия.

3.Охладите до комнатной температуры, добавьте 2 мл концентрированной соляной кислоты и в получившемся растворе суспендируйте 2 г активированного угля.

4.Оставьте на ночь в темноте при комнатной температуре.

5.Отфильтруйте активированный уголь и храните раствор красителя в холодильнике в темном контейнере.

Возможные трудности: если раствор после фильтрации по-прежнему остается розовым, то надо заменить метабисульфат. Если раствор имеет оранжевый цвет и дает оранжевый фон при окрашивании, замените основной фуксин.

104

3.1.2. Специфические вещества

Многие вещества можно окрасить специфически. Таким способом можно выявлять полимеры, например полисахариды кал-лозу и гликоген, структурные белки, такие как коллаген и гемоглобин, а также множество ферментов. Гистохимическими методами можно также выявлять низкомолекулярные вещества, от желчного пигмента до холестерола и различных витаминов. Кроме того, использование в гистохимии гибридизации in situ позволяет с помощью флуоресцентного зонда или радиоактивной метки выявлять многочисленные фрагменты нуклеиновых кислот, от генных последовательностей ДНК до цитоплазматических мРНК. Кроме того, многие биополимеры и другие более мелкие молекулы являются антигенами и могут быть в принципе выявлены с помощью иммуногистохимии. Читателю, интересующемуся более подробной информацией о ДНКзондах, флуоресценции и гистохимии хромосом, следует обратиться к гл. 3, 6 и 9.

Таблица 5.11. Избирательные методы образования альдегидных групп в биополимерах

Депуринизация ДНК путем гидролиза*

1.Распарафинируйте срезы и перенесите их в воду, намочите Криостатные и пластиковые срезы**.

2.Поместите срезы в 1 М НС1, предварительно нагретую до 60 °С, и проинкубируйте при данной температуре 10—15 мин*** ****.

Окисление 1,2-карбоксильных групп в полисахаридах $

1.Распарафинируйте срезы и перенесите их в воду, намочите криостатные и пластиковые срезы.

2.Обработайте срезы 1%-ной (объем к весу) периодной кислотой в течение 5 мин (сноска 1 к табл. 5.9).

3.Хорошо промойте препарат в нескольких сменах воды.

*Данная процедура в сочетании с методом выявления альдегидных групп, описанным в табл. 5.9, называется окрашиванием ДНК по Фёльгену.

**Для фиксации пригодны большинство фиксаторов, за исключением кислотных (типа фиксатора Буэна), которые сами по себе вызывают гидролиз ДНК (сноска 4) и глутарового альдегида, который приводит к образованию альдегидных групп во всей ткани.

***Можно использовать 5 М НС1 при комнатной температуре.

****При слишком коротком времени гидролиза не образуются все альдегидные группы, а слишком продолжительный гидролиз приведет к вымыванию ДНК из препарата. Оптимальное время зависит от условий фиксации, так что если препарат оказался бледным, попробуйте изменить продолжительность гидролиза. $ Данный метод в сочетании с процедурой выявления альдегидов, описанной в табл. 5.9, получил

название метода окрашивания периодатом — реактивом Шиффа (ШИК-метод, или, по-английски, PASметод).

Механизмы неиммунологического и негибридизационного окрашивания, которые мы здесь рассматриваем, различны. Некоторые вещества (например, желчный пигмент) можно сделать видимыми с помощью маркерного химического фрагмента или комбинации фрагментов. В других случаях маркерным может являться биофизическое свойство молекулы, например ее заряд, гидрофильность или гидрофобность, планарность и т. д. Идентификация может быть основана и на более сложных химических свойствах, как в гистохимии ферментов, где для получения окраски используется специфическая каталитическая активность фермента. Селективность может быть также обусловлена в большей степени свойствами молекулярных агрегатов, а не отдельных молекул — например, коллаген можно избирательно окрасить за счет того, что его фибриллы сильно набухают

вкислом растворе.

I. Выявление сукцинатдегидрогеназы. В этом гистохимическом методе выявления фермента препарат инкубируют в растворе, содержащем сукцинат — природный субстрат фермента — плюс соль тетразолия как индикатор окислительно-восстановительных процессов. В местах локализации фермента от сукцината каталитически отщепляется водород, в результате чего образуется фумарат, а также протоны и электроны. Ферментативный процесс выявляется за счет окисления электронами и протонами соли тетразолия, что ведет к образованию пурпурно-синего нерастворимого пигмента — формазана.

Метод выявления сукцинатдегидрогеназы описан в табл. 5.12, а приготовление необходимых для него рактивов — в табл. 5.13.

Таблица 5.12. Метод выявления сукцинатдегидрогеназы

1.Сделайте на криостате срезы толщиной 5—7 мкм и смонтируйте их на покровное стекло*. Не фиксируйте**.

2.Проинкубируйте срезы в течение 30—60 мин при 37 °С в растворе, указанном в табл. 5.13.

3.Перенесите срезы в водный раствор формалина (как указано в табл. 5.13) на 15 мин.

4.Промойте дистиллированной водой.

105

5.Если необходимо, докрасьте ядра 2%-ным (объем к весу) водным раствором метилового зеленого в течение 10 мин.

6.Промойте дистиллированной водой.

7.Проведите обезвоживание препарата в серии спиртов, затем в ксилоле и заключите его в синтетическую смолу.

Результаты: В местах локализации сукцинатдегидрогеназы откладывается пурпурно-синий формазан. Если применялась докраска метиловым зеленым, то ядра окрашены в зеленый цвет.

Контроль. Для проверки того, что окрашивание зависит от ферментативной активности, проведите процедуру, не добавляя сукцинат в инкубационную среду, или прогрейте сухие срезы при 80 °С в течение 1 часа перед инкубацией.

Возможные трудности: следы розового окрашивания могут быть удалены на 4-м этапе с помощью ацетона. Если сохраняется интенсивное розовое окрашивание, то необходимо заменить соли тетразолия.

* Для того чтобы уменьшить расход дорогих реактивов.

** Фермент ингибируется формальдегидом, так что фиксацию для сохранения морфологии можно производить только после окрашивания.

Таблица 5.13. Реактивы, необходимые для выявления сукцинатдегидрогеназы

Концентрированные растворы

Раствор субстрата

1.Растворите 6,75 г двузамещенного сукцината натрия в 10 мл дистиллированной воды.

2.Если окажется необходимым, доведите рН с помощью 1 М НС1 до 7,0—7,1. Раствор тетразолия

1.Растворите 10 мг тетразолия нитросинего (или тетразолия тетранитросинего) в 2,5 мл дистиллированной воды.

2.Добавьте 2,5 мл 0,2 М Трис-буфера (рН 7,4), 1 мл 0,05 М раствора MgCl2 и 3 мл дистиллированной воды.

Рабочие растворы

Солевой раствор формалина

1.Смешайте 15 1мл коммерческого 40%-ного (вес на объем) водного раствора формальдегида с 85 мл воды.

2.Добавьте и растворите 0,9 г NaCl. Инкубационный раствор

1.Смешайте 1 мл концентрированного раствора субстрата с 9 мл раствора тетразолия.

2.Нагрейте до 37 °С.

3.1.3.Классы веществ

Иногда получаемая методами гистохимии информация касается основных классов веществ, но не отдельных химических веществ. Так, мы можем исследовать распределение липидов в проксимальных почечных канальцах, но не можем получить какой-либо информации о конкретном составе данных липидов. Даже в тех случаях, когда существует более подробная химическая классификация, мы можем тем не менее очень мало продвинуться в идентификации отдельных веществ. Так, если пациент страдает от болезни накопления — метахроматической лейкодистрофии, то гистохимическое исследование с целью выявления сульфатидных отложений в макрофагах служит ценным методом диагностики, однако никакого более тонкого химического определения веществ в препарате с его помощью сделать

нельзя.

Еще раз отметим, что лежащие в основе гистохимических методов механизмы окрашивания очень разнообразны и включают все типы, описанные выше.

I. Выявление липидов. В основе метода лежит распределение гидрофобных неионных красителей между полярными растворителями и неполярными липидами. Усиление окрашивания после бромирования происходит благодаря тому, что по местам двойных углеродных связей присоединяются атомы брома. Бромные производные менее полярны и обычно имеют более низкую точку плавления, чем их ненасыщенные предшественники, в результате чего повышается сродство красителей к липи-дам и, соответственно, ускоряется реакция окрашивания.

Стандартная методика окраски нейтральных липидов Суданом черным приведена в табл. 5.14, метод выявления суммарных

Таблица 5.14. Стандартный метод выявления нейтральных липидов

106