методы иммуногистохимии в настоящее время все шире применяются для диагностики в гистопатологии, особенно для диагностики опухолей. Перечень областей применения этого метода неизмеримо расширился с развитием технологии получения моноклональных антител. Получен широкий спектр таких антител, причем многие из них обладают такой специфичностью, которую трудно, если не невозможно было бы достичь с помощью обычных антисывороток.

Впервых разделах (2—5) излагаются основы методов. В последующих разделах подробно описываются процедуры. В разд. 2 кратко рассматривается природа и структура антител, описывается метод их очистки, а также обсуждаются различия между поликлональной сывороткой и моноклональными антителами. Мишень для антитела называется антигеном; возможные воздействия на антиген в процессе обработки ткани обсуждаются в разд. 3. Существует множество различных меток; они описываются и сравниваются между собой в разд. 4, который содержит также описание методов конъюгации ферментов с антителами. В разд. 5 описываются и сравниваются в общих чертах различные методы применения антител для исследования срезов тканей.

Разд. 6 содержит детальное описание экспериментальных методик, в которых используются антитела, меченные ферментами. В разд. 7 обсуждаются постановка контролей и пути разрешения проблем, возникающих при интерпретации данных, в разд. 8 — способы, позволяющие визуализировать одновременно два антигена.

Хотя настоящая глава посвящена в основном использованию антител, сходные методы могут применяться и

сдругими реактивами, обладающими такой же высокой специфичностью. Например, лектины могут использоваться для определения некоторых групп углеводов. Недавно началось бурное развитие методов, связанных с использованием ДНК в качестве метки для выявления специфических последовательностей в генах или в мРНК. Эти методы описаны в разд. 9.

Большая часть главы посвящена описанию методов, применяемых для окраски срезов тканей. Те же самые методы могут использоваться и для исследования цитологических препаратов. Небольшой разд. 10 посвящен окраске мазков.

Вразд. 11 кратко обсуждаются количественные методы иммуноцитохимии, разд. 12 содержит перечень необходимого для окраски специального оборудования.

По иммуногистохимии опубликовано несколько книг, которые можно использовать для более глубокого изучения методов. В большинстве из них подробно описаны способы приложения того или иного метода к исследованию различных проблем [1-5].

2. Антитела

Антитела (их общее название иммуноглобулины, сокращенно Ig, от англ, immunoglobulins) составляют приблизительно 20% белков плазмы человеческой крови. Они продуцируются плазматическими клетками. Существуют миллионы различных вариантов антител. В процессе иммунного ответа инородное тело (антиген) стимулирует деление именно тех плазматических клеток, которые ответственны за продуцирование Ig, способного взаимодействовать с этим конкретным антигеном. Это позволяет животному продуцировать большое количество специфических антител. Организм любого животного в нормальной среде обитания находится в состоянии постоянного иммунного ответа, и в плазме его крови содержатся антитела против тысяч различных антигенов.

2.1. Структура иммуноглобулинов

Основу структуры Ig составляет димер, каждая половина которого состоит из двух полипептидных цепей. Одна из цепей, называемая тяжелой, содержит приблизительно 440 аминокислот, а другая, легкая — около 220 аминокислот. Цепи связаны между собой дисульфидными связями (рис. 4.1). Тяжелая цепь имеет невариабельную (константную) область, которой определяется класс Ig, а также вариабельную область. При конъюгации последней с вариабельной областью легкой цепи образуется участок, который связывается с антигеном. Легкие цепи бывают двух классов — каппа и лямбда.

Рис. 4.1. Упрощенная модель молекулы иммуноглобулина, на которой показаны участок связывания с антигеном и места расщепления папаином и пепсином.

«~» означает дисульфидную связь.

Основные классы Ig перечислены в табл. 4.1. Класс IgG (иммуноглобулины G) делится на подклассы: IgGl,

71

IgG2 и т. д. Во время иммунного ответа большинство иммуноглобулинов в плазме представляют собой IgG. Следовательно антисыворотка будет содержать иммуноглобулины преимущественно этого класса.

Иногда иммуноглобулины подвергают ферментативному расщеплению, чтобы получить фрагменты, которые сохраняют способность реагировать с антигеном. Пепсин расщепляет константную область тяжелой цепи за областью связывания («петли»), в результате чего образуется димерный фрагмент, называемый F(ab')2 (см. рис. 4.1). Под действием папаина образуются два мономерных фрагмента, Fab, плюс константные области тяжелых цепей, Fc. Fab-фрагменты иногда используют вместо целых Ig.

2.2. Поликлональная антисыворотка

Для получения антисыворотки группе животных вводят очищенный антиген вместе с неспецифическим стимулятором иммунного ответа — адъювантом. Описание метода можно найти в работе [6]. Если иммунизация проходит успешно, то антиген должен стимулировать множество различных лимфоцитов, каждый из которых, претерпев несколько делений, даст клон плазматических клеток, продуцирующих антитела. По этой причине иногда употребляется термин «поликлональная» сыворотка.

Таблица 4.1. Основные классы иммуноглобулинов

Участок антигена, с которым взаимодействует иммуноглобулин, называется эпитопом. Антиген может иметь несколько эпитопов, и антисыворотка будет содержать иммуноглобулины против каждого из них. Кроме того, разные Ig, направленные против одного и того же эпитопа, могут иметь различную степень сродства и могут также узнавать слегка различающиеся части эпитопа. Таким образом, антисыворотка будет содержать набор Ig, реагирующих с антигеном, но различных по специфичности и сродству. Следовательно, две антисыворотки никогда не могут быть идентичны друг другу.

Кроме большой концентрации антител, направленных против соответствующего антигена, антисыворотка будет содержать и другие Ig, которые присутствовали в ней до иммунизации. Антисыворотка может также содержать антитела, взаимодействующие с примесями, которые находились в исходном препарате антигена. Такие Ig могут давать нежелательные реакции, и их требуется удалить.

2.3. Моноклональные антитела

Многих упомянутых выше проблем можно избежать, если использовать моноклональные антитела. Моноклональные антитела получают с помощью клонированной линии клеток, продуцирующих единственный Ig. Эти клетки получают путем слияния клеток селезенки иммунизированных животных и клеток линии миеломы, чувствительных к воздействию определенного яда. После слияния клетки инкубируют в присутствии этого яда. В таких условиях расти будут только клетки-гибриды, появившиеся в результате слияния нормальных клеток селезенки (которые не чувствительны к действию яда) и клеток миеломы (от которых гибрид получает бессмертие). Гибриды клонируют, выбирают клоны, вырабатывающие специфические антитела, и выбранные клоны клонируют вновь. Каждая из получающихся в результате клеточных линий (их называют гибридомами) производит неограниченное количество определенного Ig. Полное описание этих методик можно найти в работе [7], а также в другой книге настоящей серии: Антитела. Методы л (под ред. Д. Кэтти), книга 1.

Таблица 4.2. Метод аффинной очистки антикроличьих иммуноглобулинов

1 Растворить 2,5 г сульфата аммония в 10 мл сыворотки кролика, оставить на ночь при температуре 4 °С 2 Отцентрифугировать, супернатант отбросить

3 Растворить осадок в воде и провести диализ против 0,02 М фосфатного буфера, рН 7,0

4 Поместить раствор на колонку с DEAE-сефадексом А50 (анионообменник, Pharmacia), уравновесить 0,02 М фосфатным буфером с рН 7,0 Элюиро-вать IgG тем же буфером

5 Связать кроличьи IgG с сефарозой, активированной бромцианом (Pharmacia), согласно инструкции фирмы-изготовителя, ресуспендировать взвесь сефарозы в ФСБ

72

6 Поместить IgG-сефарозу в маленькую (7 мм в диаметре и 150 мм длиной) колонку, пропустить IgG антикроличьей сыворотки через колонку 7 Промыть колонку ФСБ до тех пор, пока элюат не перестанет поглощать свет с длиной волны 280 нм

8 Элюировать специфические антикроличьи Ig с колонки с помощью 4 М гиоцианата калия, собрать фракции объемом по 1 мл и измерить их оптическую плотность при 280 нм 9 Объединить фракции, содержащие белок, и провести диализ против ФСБ (нельзя оставлять пробу в тиацианате калия, так как это может привести к денатурации Ig)

2.4. Очистка антител

Перед тем, как связать антитела с меткой, иногда необходимо произвести их очистку. Это сравнительно легко сделать, если используются моноклональные антитела из супернатанта культуры гибридомы, — достаточно осадить их сульфатом аммония и затем провести хроматографию. Если используются моноклональные антитела из асцитной жидкости или поликло-нальная сыворотка, желательно отделить специфические антитела от других Ig. Лучший способ — иммобилизовать антиген на твердый носитель и воспользоваться аффинной хроматографией. Подходящий для этого метод описан в табл. 4.2.

2.5. Специфичность реакций антител

Важнейшим свойством Ig является сродство, или аффинность, к своему антигену. Необходимая для эксперимента концентрация зависит именно от этого сродства. «Сила» поликлональной сыворотки прямо связана с концентрацией антител, умноженной на константу сродства: чем выше сродство, тем больше эффективное разведение. По причинам, перечисленным ниже, антитела с высоким сродством обычно обнаруживают большую специфичность.

Антитела используют в качестве реагентов из-за их высокой специфичности. Однако необходимо заметить, что они могут вызывать также неспецифические реакции. Это может происходить по трем причинам.

1.Из-за загрязненности антител. Это бывает только при использовании поликлональной антисыворотки и может быть обнаружено с помощью соответствующих контролей (разд. 7). Кроме того, вероятность таких осложнений снижается, если можно использовать антисыворотку в высоком разведении.

2.Из-за наличия перекрестных реакций. Такая ситуация возникает, если две молекулы имеют подобные, но все же различающиеся структуры. Некоторые антитела способны узнавать обе молекулы, и часто при нежелательной реакции сродство антител ниже, чем в основной реакции, так что проблема возникает только при использовании антител в слишком высокой концентрации. По этой причине также желательно использовать антитела с высоким сродством.

3.Из-за того, что две молекулы имеют одинаковый эпитоп. Эту возможность нельзя проверить с помощью обычных контролей. Обычно ее можно определить только с помощью детального иммунохимического изучения.

2.6. Хранение антител

Антитела и антисыворотку, приобретенные коммерческим путем, следует хранить согласно инструкции изготовителя. Реактивы, полученные иным путем, должны храниться без предварительного разведения. Желательно расфасовать их на подходящие аликвоты и хранить аликвоты замороженными. Если вещество было хотя бы раз разморожено, его не следует замораживать снова, так как процессы замораживанияоттаивания ведут к денатурации Ig.

Если антитела используются редко, их можно хранить в виде порций, каждой из которых достаточно для одного эксперимента, и размораживать порции по мере необходимости. Если объем аликвоты измеряется микролитрами, то для предотвращения высыхания поверх аликвоты наносят перед замораживанием небольшое количество глицерина.

Если вещества используются регулярно, их можно хранить в аликвотах большего объема. Мы обнаружили, что большинство антисывороток не портится при 4 °С в течение по крайней мере месяца, а иногда и несколько дольше. Чтобы предотвратить бактериальное заражение, такие реактивы мы всегда готовили на 0,01%-ном растворе азида натрия. Если обнаружилось, что реактивы все-таки заражены, их следует немедленно ликвидировать.

3. Воздействие на антигены процедуры обработки ткани

Прежде чем применять антитела, необходимо приготовить срезы исследуемой ткани. Перед тем как решить, каким образом подготовить ткань для изготовления срезов, необходимо учесть воздействие каждой из процедур, используемых в ходе этой подготовки, на антиген.

Обычно, когда срезы предполагается окрашивать гематоксилином и эозином, ткань фиксируют, чаще всего формалином, и заливают в парафин. После изготовления срезов парафин удаляют, погружая препарат в ксилол или подобный ему растворитель; далее переносят через спирт в воду. При такой обработке получаются срезы

73

высокого качества, но она приводит к изменению структуры тканевых белков, так что многие антигены теряют способность реагировать с соответствующими антителами. В этом случае можно попытаться применить другие методы фиксации и обработки ткани, но часто приходится делать срезы с замороженной ткани.

3.1. Выбор условий обработки ткани

Начиная работу с новыми антителами, необходимо подобрать оптимальные условия фиксации и обработки ткани. И хотя эти условия устанавливают только эмпирическим путем, можно наметить некоторые направления поиска.

Нужно отобрать несколько фиксаторов. В нашей лаборатории мы применяли формалин, метакарн, 90%-ный этанол, раствор Буэна, хлороформ—ацетон и кальций—формол с последующей обработкой смесью хлороформа с ацетоном. Пригодность каждого из фиксаторов проверяется на наборе срезов, полученных с замороженных тканей. С ткани, содержащей интересующий антиген, делают несколько замороженных срезов и погружают их по одному на 5 мин в каждый из выбранных фиксаторов. Далее срезы окрашивают антителами, используя выбранный для этого метод, и анализируют результаты. Если оказывается, что все выбранные фиксаторы разрушают антиген, эксперимент следует повторить, используя более мягкие фиксаторы (например, параформальдегид — лизин — периодат). Иногда окрашивание должно выполняться на срезах без предварительной фиксации материала. Следует учитывать, что на таких, срезах плохо видна общая морфология ткани.

Прописи различных фиксаторов, включая те, о которых говорилось выше, а также некоторые указания по их использованию даны в табл. 4.3.

Если антиген сохраняется при использовании одного или более фиксаторов, ткань фиксируют в том из них, который кажется наиболее подходящим, и заливают в парафин. Далее изготавливают и окрашивают срезы. Если антиген разрушается в процессе заливки, то необходимо использовать парафин с более низкой температурой плавления (45° вместо 58°С). На этой стадии можно при необходимости выбрать оптимальные условия с учетом особенностей антител.

Таблица 4.3. Прописи для наиболее часто употребляемых фиксаторов

А. Фиксаторы, используемые для тканей, заключаемых затем в парафин.

1.10%-ный солевой раствор формалина (100 мл 40%-ного формальдегида, 9 г NaCl в 900 мл воды).

2.Метакарн (60% метанола, 30% хлороформа, 10% ледяной уксусной кислоты; ткань обычно фиксируют при комнатной температуре в течение ночи, а затем переносят в 70%-ный спирт).

3.Модифицированный метакарн (содержит ингибизол вместо хлороформа).

4.Раствор Карнуа (60 мл этанола, 30 мл хлороформа, 10 мл ледяной уксусной кислоты).

5.Раствор Буэна (75 мл концентрированной пикриновой кислоты, 25 мл 40%-ного формальдегида, 5 мл уксусной кислоты).

6.В5 (60 г хлорида ртути, 21 г CH3COONa. 3H2O в 900 мл воды; перед использованием добавить 100 мл 40%-ного формальдегида; если используется этот фиксатор, то после изготовления срезов и перед выполнением иммунохимического окрашивания ртуть должна быть удалена, для чего следует:

а) перенести срезы в воду;

б) поместить их на 5 мин в раствор Люголя (2 г KI и 1 г иода в 100 мл воды); в) промыть в воде;

г) погрузить на несколько секунд в 5%-ный (вес на объем) раствор тиосульфата натрия; д) промыть в воде.

Б. Фиксаторы, обычно используемые при получении замороженных срезов.

7.Кальций — формол (100 мл 40%-ного формальдегида, 100 мл 1 М 800 мл воды плюс несколько крошек мрамора (или СаСОз). Хранить при температуре 4°С; после данной фиксации проводится дополнительная фиксация методом хлороформ — ацетон).

8.Хлороформ — ацетон (50 : 50 (объем на объем) хлороформа и ацетона; фиксировать в течение 5 мин при 4°С. Часто используется для фиксации замороженных срезов перед окраской моноклональными антителами, когда нужно выявить различные фенотипы лимфоцитов).

9.Этанол — уксусная кислота (95% этанола, 5% ледяной уксусной кислоты; фиксировать замороженные срезы в течение 1 мин при 4 °С).

10.Этанол (Фиксировать этанолом в различных концентрациях при 4 °С или при комнатной температуре; Время фиксации определить в предварительном опыте).

11.Формальдедегид — лизин— периодат:

а) Приготовить 3,6% (вес на объем) раствор парафор-мальдегида, растворив 2 г в буфере, содержащем

0,14 М NaH2PO4, 0,11 М NaOH при 70 °С.

б) Профильтровать, охладить и добавить 2,5 мл 1 М НCl;

в) Приготовить раствор лизина, доведя рН 0,2 М раствора лизина в НС1 до 7,4 с помощью 0,1 М двузамещенного фосфата натрия.

74