антителами, выделяется из бычьего кишечника.

6.5.2. Мера предосторожности

Щелочная фосфатаза может ингибироваться фосфатным буфером. Поэтому, если последние антитела отмывались фосфатным буфером, как рекомендуется в методике, приведенной в табл. 4.10, то перед проведением цветной реакции срезы необходимо тщательно промыть.

6.5.3. Хромогенные вещества для выявления щелочной фосфатазы

Быстрый красный. Этот хромоген обычно применяют для выявления щелочной фосфатазы. Он дает красный осадок, растворимый в этаноле.

1.Растворите в стеклянном бюксе 5 мг двузамещенного фосфата натрий-А5-В1-нафтола в нескольких каплях ДМФ.

2.Добавьте 5 мг трехзамещенной соли быстрого красного в 10 мл веронал-ацетатного буфера, рН 9,2.

3.Добавьте, если необходимо, левамисол. Профильтруйте.

4.Проинкубируйте стекла со срезами в течение 1 часа и промойте их водой.

5.Докрасьте гемалауном Майера и заключите в глицериновое желе.

6.Интенсивность реакции может быть увеличена, если через 30 мин добавить новую порцию субстрата. Соль быстрого синего. Дает синий осадок, растворимый в этаноле.

1.Растворите 5 мг соли быстрого синего ВВ в 10 мл 0,1 М Трис-буфера (рН 9,0) и добавьте 5 мг

двузамещенного фосфата натрий-А8-В1-нафтола в ДМФ, как указывалось выше.

2.Добавьте, если необходимо, левамисол. Профильтруйте.

3.Проинкубируйте препарат в течение 15 мин, заменяя каждые 5 мин раствор субстрата. Промойте водой. При использовании данного красителя возникают трудности с подбором способа докраски, так как гемалаун

окрашивает ядра в синий цвет, а метиловый зеленый растворим в воде, тогда как синий осадок растворим в ксилоле.

Новый фуксин. Дает красный осадок, нерастворимый в спирте и ксилоле.

1.Смешайте 250 мкл 4%-ного нового фуксина в 2 М соляной кислоте с 250 мкл 4%-ного NaNO3 и выдержите раствор 5 мин на холоде.

2.Добавьте 40 мл 0,2 М буфера Трис-HCl (рН 9,0), а затем добавьте 10 мг двузамещенного фосфата натрий- АS-ТR (или AS-BI)-нафтола, растворенные в 0,2 мл ДМФ.

3.Добавьте, если необходимо, левамисол. Профильтруйте. Проинкубируйте срезы в течение 10 мин.

4.Докрасьте гемалауном Майера и заключите в DPX.

6.6. Глюкозооксидаза

В качестве хромогена для выявления глюкозооксидазы часто используется тетразолий нитросиний, который дает темно-синий осадок, нерастворимый в спирте и в ксилоле. При этой реакции нет необходимости блокировать активность эндогенного фермента.

1.Растворите 335 мг p-D-глюкозы и 33,5 мг тетразолия нитро-синего в 50 мл 0,05 М Трис-буфера (рН 8,3).

2.Выдерживайте раствор в течение 1 часа при 37 °С в темноте, после чего добавьте 8,3 мг феназинметасульфата (это вещество может быть канцерогенным, так что обращаться с ним следует осторожно).

3.Проинкубируйте срезы в течение 1 часа при 37 °С в темноте, затем промойте их водой.

4.Докрасьте препарат 0,1%-ным раствором метилового зеленого и заключите в DPX.

6.7. Галактозидаза

Если используются реактивы, указанные ниже, то продукт реакции имеет синий цвет, стабилен в этаноле и ксилоле. При использовании данной реакции нет необходимости блокировать активность эндогенного фермента. 1. К 7 мл ФСБ, содержащего 1 мМ MgCl2 (рН 7,0), добавьте

0,5 мл 50 мМ феррицианида калия и 0,5 мл 50 мМ ферроцианида калия.

2.Добавьте 10 мг 5-бром-4-хлор-3-инцолшьр-О-галактозидазы, заранее растворенной в 1 капле ДМФ (этот раствор можно хранить замороженным в течение 2 месяцев).

3.Проинкубируйте срезы в данном растворе в течение 1 часа при 37 °С, затем промойте их водой.

4.Докрасьте препарат 0,1%-ным раствором метилового зеленого и заключите в DPX.

Таблица 4.12. Усиление серебром окраски коллоидным золотом

Перед добавлением первых антител.

1.Промойте срезы водой.

2.Погрузите срезы на 5 мин в йодный раствор Люголя (этап 5, табл. 4.3).

3.Промойте препарат в 2,5%-ном (вес на объем) водном растворе тиосульфата натрия.

4.Промойте в СТБ с 1% тритона-Х-100.

Нанесите антитела, как указано в табл. 4.10, заменив солевой Трис-буфер (СТБ) на ФСБ, и возьмите на

86