помещается лишь малая часть целого органа. В большинстве приведенных работ даются превосходные статистические тесты для определения того, достаточно ли вы подсчитали точек, чтобы достичь заданной точности результатов.

Методы получения количественных данных при работе со срезами, основанные на подсчетах числа точек, сейчас хорошо-разработаны и удобны. Изложенное выше может служить лишь введением в проблему, и, прежде чем начинать работу, любой микроскопист, намеревающийся использовать данные методы,, должен воспользоваться некоторыми или даже всеми работами, ссылки на которые приведены в конце главы.

4. Измерения с использованием дигитайзера

Всвязи с быстрым развитием в последние годы микрокомпьютеров совершился переворот и в методах получения данных и измерений на микроскопе. Стали общедоступными микрокомпьютеры с большим объемом внутренней памяти и с внешней памятью в виде твердого диска емкостью 30 мегабайт и более. К ним выпускаются коммерческие программы, позволяющие собирать и обрабатывать данные.

Один из методов введения данных с изображения, получаемого в световом или электронном микроскопе, состоит в том, что изображение проецируется на планшет дигитайзера (рис. 7.9,Л). Изображение проецируется на рабочую поверхность планшета (можно также воспользоваться рисунком или фотографией, которые кладут прямо на поверхность), и с помощью курсора или соединенной с электронной частью дигитайзера ручки оператор обводит контуры интересующего его объекта (рис. 7.9,5). Движения курсора преобразуются электронной частью в координаты, которые передаются на микрокомпьютер, вычисляющий величины площадей, периметров, линейные размеры, факторы формы и т. д. в зависимости от потребностей исследователя. До последнего времени планшет дигитайзера был наиболее удобным средством для введения данных в микрокомпьютер, осуществляющий вычисления. Теперь, однако, изображение обычно вводится с помощью телекамер, а планшет дигитайзера, если он подсоединен к системе, обычно используется для редактирования изображения, которое хранится в памяти компьютера.

Вбольшинстве дигитайзеров для определения положения курсора используется магнитострикционный эффект. Для этого в рабочую поверхность планшета вмонтирована правильная сетка из намагниченных проволочек. На проволочки подаются импульсы высокой частоты, генерируемые катушками, которые окружают концы проволочек. Эти импульсы, проходя по проволочкам, вызывают небольшие изменения их длины. На конце курсора или специальной ручки имеется другая спираль, которая воспринимает эти изменения. Микропроцессор, расположенный в электронной части ручки дигитайзера, измеряет запаздывание по координатам х и у, и, таким образом, устанавливает координаты курсора. Они определяются весьма точно (обычно с точностью, превышающей 0,1 мм) и зависят от частоты импульсов, подаваемых на проволочки, в большей степени, чем от расположения проволочек в планшете.

Рис. 7.9. А. Типичный планшет дигитайзера, используемый для получения количественных данных с помощью микрокомпьютера. Обратите внимание на лежащий на планшете курсор с воспринимающей катушкой.

Б. Использование планшета для обведения с помощью курсора контуров структур.

Использование планшета дигитайзера для получения данных позволяет, обводя профиль объекта один раз, измерить одновременно несколько параметров. Более важно, однако, то, что данный тип систем позволяет

144

микроскописту выбрать значимые элементы изображения для измерений и не рассматривать несущественные детали или артефакты. Использование дигитайзеров неудобно тем, что оператор устает от очень большого числа измеряемых профилей. Кроме того, возможны ошибки, возникающие из-за неаккуратности оператора при обведении профилей. Если фактическая площадь профилей должна быть больше определенной величины (обычно для круглых профилей — около 16 мм2, то ошибки такого рода будут порядка 6%, что приемлемо для большинства биологических исследований (подробнее [16]). Но такая оценка справедлива для фигур с простым контуром; если контуры сложные, ошибка при прорисовке, естественно, возрастает. Ее можно скомпенсировать, увеличивая изображение, накладываемое на дигитайзер.

При наличии общедоступного программного обеспечения дигитайзеры могут использоваться для получения пространственных координат, расстояний между точками, измерений площадей, периметров, максимальных хорд, диаметров Фере и некоторых других обычных измерений. В настоящее время многие системы позволяют хранить помимо результатов измерений и вторичные (расчетные) данные, такие, как фактор формы или диаметр эквивалентной окружности. Последний параметр вычисляется таким образом: по измеренной площади объекта рассчитывается диаметр круга, площадь которого равна измеренной. Это очень полезный параметр, позволяющий попарно сравнивать объекты вне зависимости от их ориентации и формы. Например, чтобы получить распределение нервных волокон по толщине, традиционно производят серии измерений с помощью окуляр-микрометра. Такие измерения дают хорошие результаты только в тех случаях, когда объекты имеют круглую форму. При любой неправильности профиля (например, в случае эллипсоидальности, возникающей вследствие косой ориентации среза) возникает проблема: какой из возможных диаметров следует измерять? Используя для измерения площадей дигитайзер и микрокомпьютер и рассчитывая затем диаметр эквивалентного круга, можно избежать подобных затруднений.

Еще одним преимуществом измерений с помощью соединенного с микрокомпьютером дигитайзера является простота, с которой первичные («сырые») данные могут заноситься и храниться на магнитном диске. Это позволяет легко вызывать их для внесения дополнений или проведения различных статистических анализов.

Системы, основанные на присоединенном к микрокомпьютеру дигитайзере, очень просты в работе, хотя варианты устройств различаются в зависимости от типа используемого микрокомпьютера, а также от конструкции модулей программного обеспечения. Из-за этих различий здесь нет возможности дать краткое описание всей процедуры по этапам; пользователям следует обратиться к описаниям их систем. Для большинства систем требуется, чтобы сначала в них была загружена программа с диска компьютера и оператор с помощью меню выбрал требуемые операции, например измерение площадей, длин, периметра, фактора формы и т.д. Затем изображение переносится на активную часть планшета дигитайзера, где нужные объекты обводятся специальным пером или курсором. Если изображение проецируется на дигитайзер с помощью зеркала или призмы, то пером или курсором просто обводят контуры объекта. Можно также работать с дигитайзером и рисовальным тубусом микроскопа. Это позволяет одновременно наблюдать за активной зоной дигитайзера и изображением в микроскопе. В этом случае курсор или перо снабжается миниатюрным светоизлучающим диодом, который обозначает в поле зрения расположение курсора. Таким образом, движения курсора по планшету в поле зрения выглядят как движения огонька по изображению в микроскопе, что и позволяет обвести интересующие вас контуры. Если измерения необходимо проводить в реальных единицах, а не в условных машинных, то, конечно, вам необходимо перед началом измерений провести калибровку с помощью объект-микрометра. По окончании любых измерений требуемые параметры обычно рассчитываются

ивыводятся на монитор или принтер, подсоединенный к системе.

5.Измерения с помощью анализаторов изображения, основанных на телевизионных системах

В большинстве современных анализаторов изображения (например, в новом приборе Magiskan, рис. 7.10) получаемое в микроскопе изображение проецируется на фотокатод видикона или на матрицу ПЗС-камеры. Это изображение создает определенное распределение проводимости, зависящей от яркости различных районов; когда тонкий пучок электронов сканирует, двигаясь по правильному растру, поверхность фотокатода, происходящая при этом нейтрализация заряда создает на коллекторе разность потенциалов, пропорциональную начальному распределению яркости. Если величину данного сигнала снимать через регулярные промежутки времени, то можно получить числовое представление изображения. Каждое число тогда представляет отдельную точку изображения, или пиксел. Во многих анализаторах изображения оно представляется в виде 512x512 пикселов, каждому из которых присваивается оптическая плотность, или «уровень серого», в виде чисел от 0 (соответствующего черному цвету) до 255 (соответствующего белому цвету). Любое изображение, обработанное таким образом, может храниться в памяти компьютера для дальнейшей обработки и проведения измерений. Максимальное количество обработанных изображений, которое может храниться, зависит от объема памяти микрокомпьютера и от количества уровней серого в каждом изображении. Многие анализаторы изображения имеют свои собственные компьютеры с большим объемом памяти (порядка 8 мегабайт и более), которые позволяют хранить 12 или более изображений, оцифрованных через 8-битный аналого-цифровой преобразователь (АЦП) на 256 уровней серого.

145

Рис. 7.10. Фотография нового прибора

Magiscan фирмы Joyce-Loebel Ltd. Это типичный современный анализатор изображения. На столе находятся мониторы, микроскоп и телевизионная камера, служащая для ввода изображения, которое обрабатывается и хранится в блоках, располагающихся в стойке справа. Фотография любезно предоставлена Joyce-Loebel Ltd.

5.1. Обработка и дискриминация (сегментация) изображений

Прежде чем проводить какие-нибудь измерения на оцифрованном изображении, необходимо убедиться, что компьютер оперирует только с теми частями изображения, которые представляют интерес. Это в свою очередь требует обработки изображения для удаления из него несущественных деталей. Когда данные берутся с дигитайзера, то это упрощение и узнавание структур делается оператором, который обводит только существенные детали. Когда для обработки используется телевизионная система, предварительная обработка должна, по-возможности, проводиться на компьютере; часто требуется значительно преобразовать изображение, чтобы перевести его в пригодный для анализа вид. Хорошие советы по цифровой обработке изображения можно найти в техническом описании [17] или в книге Гонсалеса и Винтца [12].

Поскольку каждый пиксел представлен в памяти компьютера числом, то сравнительно просто написать программы, которые будут изменять значения одного или нескольких пикселов по установленным правилам. В простейшем случае с каждым пикселом можно оперировать отдельно, не изменяя величину соседних пикселов. Например, чтобы получить представление о распределении в изображении уровней серого, можно построить на экране монитора гистограмму частоты распределения всех пикселов по уровням серого. Если гистограмма получается очень узкой (когда изображение малоконтрастное), то можно дать команду компьютеру разнести значения пикселов по всей шкале (расширить гистограмму), чтобы увеличить контраст. Другим примером обработки изображения (по точкам) является случай, когда каждому пикселу присваивают обратное (комплементарное) значение. Это приводит к тому, что все изображение становится обратным: все белые пикселы — черными, и наоборот. Если в памяти находятся два изображения, тогда каждый пиксел одного изображения может быть добавлен к другому, либо вычтен из него, либо умножен или разделен на соответствующий пиксел другого изображения. Добавление применяется для наложения изображений, тогда как вычитание дает возможность убрать постоянный фон или определять движение объекта.

Наиболее часто обработка изображения перед проведением измерений включает групповую обработку, когда конечное значение пиксела определяется значениями соседних пикселов. Такой процесс часто называют пространственной сверткой (конволюцией). Оцифрованное изображение используется на входе, а величина (то есть яркость) пиксела на выходе зависит от значений пикселов в группе, называемой «ядром», которая окружает данный пиксел. Размер ядра может быть любым, чаще всего оно представляет собой матрицу величиной 3X3 или 5x5 пикселов. Последняя дает относительную свободу манипулирования изображением, но уменьшает время, приходящееся на математическую обработку. Данный процесс можно проиллюстрировать на примере простого усреднения. Здесь величина пиксела равна сумме значений соседних пикселов, образующих ядро изображения на входе, деленной на число пикселов в ядре. Если мы имеем ядро размером 3X3 пиксела со значениями

тогда величина центрального пиксела после усреднения станет 130. Можно делать пропорциональное усреднение, вводя поправочный коэффициент к каждому участвующему в усреднении элементу. Такой коэффициент часто называют коэффициентом свертывания, а матрица коэффициентов свертывания

используемая для каждого данного ядра, называется «маской свертывания». Так для ядер размером 3X3 пиксела в ней будет девять различных коэффициентов (А—I), которые будут по очереди прилагаться к каждому элементу вводимого изображения. Допустим, что маска свертывания содержит следующие значения для каждой клетки

146

Конечное значение центрального пиксела в изображении на выходе получается следующим образом: произведение пиксела № 1 и величины А в маске свертывания суммируется с числом, полученным при умножении пиксела № 2 на величину В из маски, и так далее. Таким образом, значение центрального пиксела будет равно (-10) + (-15) + (-15) + (-10) + (342) + (-10) + + (-10) + (-10) + (-15) =247 вместо начального значения 38. Данную процедуру надо последовательно произвести над каждым индивидуальным пикселом первичного изображения, так что, очевидно, требуется изрядное количество действий умножения и сложения для получения из исходного изображения модифицированного. Этим объясняется необходимость использования компьютеров значительной мощности для обработки изображений.

Маска свертывания, использованная в приведенном выше примере, называется «высокопропускающим фильтром». Сумма ее коэффициентов равна 1, и в центре имеется большое значение, окруженное меньшими отрицательными значениями. Это означает, что центральный пиксел в группе входных пикселов имеет при обработке большой вес, тогда как окружающие пикселы как бы смягчают его. Если центральный пиксел намного ярче соседей (то есть его численная величина больше), то окружающие пикселы не оказывают влияния, и выходной пиксел становится ярче исходного пиксела, в результате чего возникают градиенты или резкие переходы. Если разница между центральным и соседними пикселами небольшая, то в результате применения высокопроницаемого фильтра происходит усреднение их значений.

Противоположный тип маски свертывания получил название «низкопропускающего фильтра». Его применение ведет к размыванию деталей, поэтому он используется для подавления шумов в изображении, которые обычно возникают из-за пикселов с очень высокими численными значениями. Типичный низкопропускающий фильтр размером 3 x 3 пиксела имеет следующий состав:

из которого видно, что все компоненты положительны и их сумма равна 1. Если применить низкопропускающий фильтр, то области со сравнительно небольшими колебаниями уровня серого будут изменяться мало, тогда как зоны е резкими колебаниями усреднятся и дадут на выходном изображении сравнительно плавные переходы. Это создает эффект размывания деталей картины.

Кроме того, имеется множество других масок свертывания. Некоторые из них, часто называемые «градиентными фильтрами», служат для усиления контраста границ вдоль определенных направлений, тогда как другие (например, фильтры Лапласа) усиливают контраст во всех направлениях. Различные маски свертывания можно последовательно применить к одному и тому же изображению, и с их помощью часто можно так отредактировать изображение, что необходимые детали станут узнаваемыми для компьютера.

Многие из современных анализаторов изображения имеют специальное программное обеспечение для геометрического преобразования изображений. В эти операции может входить растяжение изображения по отношению к оригиналу по горизонтали или по вертикали, вращение изображения и искривление его по соответствующим правилам.

К следующему типу преобразований изображения, выполняемых на бинарных изображениях, то есть таких, где значения всех пикселов составляют 0 (черные) или 255 (белые), относятся эрозия (поверхностное разрушение) и дилятация (наращивание или расширение), а также комбинация этих операций (рис. 7.11). При дилятации структурные элементы (ими часто являются расположенные квадратом или восьмиугольником группы пикселов) автоматически накладываются на каждый пиксел бинарного изображения. Центральная часть группы пикселов будет попадать то на фон, то на изображение деталей. Когда происходит последнее, все пикселы расширяющего элемента, которые не попали ни на один из пикселов изображения, добавляются к последнему. В результате границы объекта в изображении расходятся и пробелы в нем заполняются, как показано на рис. 7.11. Обратная операция — это эрозия, при которой центральный пиксел тоже накладывается на анализируемое изображение. Если все пикселы из структурного элемента попадают на изображение, то центральный пиксел изображения сохраняется. Если же один или более окружающих пикселов структурного элемента попадают на фон, когда центральный пиксел оказался на изображении, тогда центральный пиксел из бывшего изображения делается белым, то есть «вымывается». Данный процесс повторяется для всех пикселов, составляющих бинарное изображение объекта. В результате от границ объектов отделяются слои, увеличиваются пробелы, и объекты разделяются (рис. 7.11). Можно проводить эрозию и дилятацию последовательно несколько раз или сначала эрозию, затем дилятацию, и наоборот. Дилятация с последующей эрозией того же количества элементов называется в технике «соединением». Эта процедура очень полезна для заполнения пробелов или сколов в изображениях объектов. Проводить ее следует осторожно, так как близко расположенные, но не связанные объекты могут в результате данной процедуры объединиться и нельзя будет измерить их по отдельности. Противоположный процесс — эрозия с последующей дилятацией — называется «разъединением». Он очень важен для очистки изображения, например для удаления выпячиваний и усов (рис. 7.11) и особенно для последующего измерения периметров, поскольку при разъединении ликвидируются

147