подходящих длин волн возбуждения (возбуждающие фильтры) и испускания (запирающие фильтры), а также дополнительные линзы. Флуоресценцию можно наблюдать визуально, фотографировать, или измерять при помощи фотоумножителя (ФЭУ).

3.1. Способы освещения

Во флуоресцентной микроскопии используются два способа освещения препарата: проходящим светом [1, 11] и падающим, светом [10, 12].

3.1.1. Освещение проходящим светом

Ход лучей показан на рис. 6.2. Конденсор фокусирует возбуждающий свет в поле зрения микроскопа. Испускаемая флуоресценция собирается объективом и наблюдается с помощью окуляров. При такой конфигурации прибора достаточно двух линз: с помощью одной (конденсор) фокусируется возбуждающий свет, с помощью другой (объектив) собирается испускаемый свет. Для получения оптимальных условий наблюдения две эти линзы, имеющие собственные оптические оси, должны быть хорошо отъюстированы. Достичь точной юстировки и затем поддерживать ее при постоянной работе не так просто.

Рис. 6.2. Схема освещения проходящим светом. И — источник света; ВФ — возбуждающий фильтр; 3— зеркало; К —конденсор; П — препарат; О — объектив; ЗФ— запирающий фильтр; Ок — окуляр. Сплошная линия — возбуждающий свет; штрихпунктирная линия — свет флуоресценции.

Недостатком освещения проходящим светом является то, что при освещении светлопольным конденсором практически весь возбуждающий свет попадает в объектив. Поскольку интенсивность возбуждающего света часто на несколько порядков выше интенсивности света флуоресценции, то для их разделения требуются фильтры очень высокого качества. Чтобы избежать этой проблемы, можно воспользоваться темнопольным конденсором, который освещает препарат под таким углом, что никакой прямой возбуждающий свет не попадает в объектив. Это содействует разделению возбуждающего света и света 'флуоресценции, которое в основном производится с помощью запирающих светофильтров. Но, с другой стороны, темнополь-ные конденсоры пропускают намного меньше возбуждающего света, чем светлопольные конденсоры. В случае применения проходящего света в сочетании с объективами большой оптической силы требуется помещать между конденсором и предметным стеклом иммерсионное масло, что также создает неудобства при постоянной работе. Недостатком освещения проходящим светом является и то, что трудно совмещать флуоресценцию с фазовым контрастом или светлопольной микроскопией.

Рис, 6,3, Схема освещения падающим светом. СДЗ — светоделительное зеркало. Все остальные обозначения как на рис. 6.2.

118