морфологическим данным, в препаратах нормальной ткани большинство клеток с высоким содержанием ДНК имели увеличенное, правильной формы бледное ядро, тогда как ядра в препаратах, полученных с патологических участков, часто имели неправильную форму и обладали гиперхроматизмом. Эти результаты легли в основу создания автоматической системы анализа телевизионного изображения (LEYTAS) для исследования цитологии шейки матки (разд. 6).
Количественное определение нуклеиновых кислот с помощью микрофлуориметрии проводится также во многих других лабораториях [30, 31, 40].
6. Анализ изображения при флуоресценции
Вместо того чтобы наблюдать полученное в микроскопе изображение с помощью окуляров, его можно ввести в телевизионную камеру, присоединенную к микроскопу. Компьютеры для анализа изображения, соединенные с такими микроскопами, могут анализировать это телевизионное изображение после его превращения в цифровое изображение. Примером такого прибора является Лейденская система телевизионного анализа (LEYTAS). Она состоит из микроскопа с автоматическим управлением, телевизионной камеры, компьютера для анализа изображения (Leitz, ФРГ) и буферной памяти (рис. 6.8). Эксперименты по анализу изображения на данной установке показали, что при достаточно яркой флуоресценции отношение сигнал/шум является вполне адекватным. В качестве примера можно отметить, что телевизионное изображение препарата, окрашенного для определения антиядерного фактора, имело достаточную яркость и контраст. С помощью специальных методов и системы LEYTAS можно автоматически отбирать ядра в соответствии с заранее поставленными условиями, избегая артефактов [41]. Такая возможность имеет большое значение для поисков клеток, встречающихся со столь низкой частотой, что их поиск вручную занимает слишком много времени. Применение подобных исследований описано в следующем разделе.
Рис. 6.8. Система LEYTAS для анализа флуоресцентного изображения. Микроскоп соединен с телекамерами: одна (вверху) работает при поглощении света, другая (слева) — при флуоресценции. Микроскоп работает под контролем компьютера. Впереди на фотографии видны кабели, соединяющие микроскоп с компьютером. Проводимый компьютером скрининг можно отслеживать на мониторе и общаться с системой через терминал. Монитор на терминале выдает количественные данные скрининга.
6.1. Телевизионный анализ при определении редких мутантных клеток
С точки зрения исследований окружающей среды очень важно разработать тест, с помощью которого можно было бы выявлять возможную токсичность различных веществ или радиации непосредственно для человека. Исходя из того что точечные мутации в эритроцитах проявляются в виде отклонений в структуре гемоглобина, один из таких аномальных гемоглобинов — гемоглобин S (HbS) — был выбран для дальнейших исследований как тест на возникновение мутации. Клетки, содержащие гемоглобин S, которые могут быть выявлены с помощью меченных ФИТЦ антител против HbS [42], у «нормальных» людей встречаются исключительно редко. По визуальным подсчетам их частота составляет 1 на 10 миллионов эритроцитов. Разумеется, такие подсчеты не могут производиться постоянно. Автоматизированная система анализа изображения значительно лучше приспособлена для данной работы: скорость скрининга будет выше и процесс скрининга не зависит от разведения препарата или утомляемости оператора. Проточная цитометрия не может быть использована для определения этих редких мутантов, поскольку при данном методе процедуры исключения артефактов не столь надежны, как при цитометрии,, основанной на анализе изображения. При проточной цитометрии невозможно выявить несколько истинных мутантов на фоне большого числа артефактов. Даже если добиться снижения частоты артефактов, с помощью проточной цитометрии нельзя визуально оценить положительные клетки, и таким образом, она непригодна для обнаружения редких событий.
Для данного исследования используются большие предметные стекла размером 8x8 см, на которые осаждаются центрифугированием примерно 50 млн клеток. Используются эффективные поликлональные антитела против HbS, которые дают сильную флуоресценцию ФИТЦа на фоне слабой флуоресценции нормальных эритроцитов, содержащих гемоглобин А. Контраст получаемого в микроскопе изображения вполне достаточен для автоматической цитометрии.
128