светофильтров (например, светофильтры, подобранные для флуоресцеина, заменять на светофильтры для родамина, и наоборот) во время наблюдения одной и той же клетки.

Таблица 4.14. Изготовление срезов для гибридизации in situ

А. Замороженные срезы.

1.Нарежьте замороженные срезы на предварительно подготовленные стекла**.

2.Высушите их при 37 °С в течение 1 часа.

3.Погрузите в кальций—формол на 5 мин при 4°С.

4.Промойте в ацетоне.

5.Погрузите в хлороформ—ацетон на 5 мин при —20 °С.

6.Промойте в ацетоне при —20 °С.

7.Тщательно промойте раствором 2xSSC**, содержащим 1 мМ ЭДТА.

8.Обезводьте в растворах этанола с возрастающими концентрациями и высушите на воздухе.

Б. Парафиновые срезы фиксированных формалином тканей.

1.Нарежьте замороженные срезы на подготовленные стекла1 >, перенесите их в воду, как обычно, и наконец, промойте их в дистиллированной воде.

2.Обработайте срезы протеиназой К. (раствор содержит 200 мкг/мл протеиназы К, 2 мМ СаС12, 0,02 М Трис-HCl, рН 7,4) при 37 °С в течение 1 часа. (Оптимальное время обработки варьирует в зависимости от блока и его следует определить экспериментально.)

3.Промойте стекла дважды дистиллированной водой (по 10 мин при 4°С, слегка покачивая).

4.Погрузите на 5 мин в 70%-ный этанол.

5.Погрузите на 5 мин в 95%-ный этанол.

6.Промойте абсолютным этанолом.

*Для подготовки предметных стекол промойте их детергентом, затем тщательно промойте проточной и дистиллированной водой. Высушите их в сушильном шкафу. Нанесите на стекло 20 мкл раствора поли-L-лизина (1 мг/мл) и дайте ему растечься. Отметьте покрытую поверхность стекла и оставьте его сохнуть в защищенном от пыли контейнере.

**Чтобы приготовить десятикратный концентрат раствора 2xSSC, растворите 175,3 г NaCl и 88,2 г цитрата натрия в 800 мл воды, доведите рН с помощью 10 N NaOH до 7,0, затем доведите объем до 1 литра.

9. ДНК-зонды для гибридизации in situ

Методики описаны в табл. 4.14—4.16. Прежде, однако, необходимо рассмотреть принципы, на которых основан метод зондов.

9.1. Принцип метода гибридизации

Существует возможность размножать протяженные участки ДНК млекопитающих в бактериях или дрожжах. Один из методов состоит в использовании плазмид, которые являются маленькими кольцевыми молекулами двуспиральной ДНК. Плазмиды реплицируются одновременно с ДНК хозяина. Благодаря маленьким размерам плазмид их ДНК легко отделить от ДНК бактерий или дрожжей, где они находятся. С помощью специальных ферментов в плазмиды могут быть встроены короткие отрезки чужеродной ДНК, которые затем размножаются за счет роста бактериальной клетки-хозяина. Культуры клонируют, и колонию, содержащую ДНК необходимой длины, выделяют. Эту колонию можно культивировать и получить тем самым неисчерпаемый источник определенного участка молекулы ДНК.

Если двуспиральную ДНК нагреть, то ее цепи разъединяются. Этот процесс называется денатурацией. При охлаждении комплементарные цепи воссоединяются, или ренатурируют. Одноцепочечная ДНК будет также соединяться с комплементарной мРНК. Если подходящим образом пометить клонированную ДНК, то ее можно использовать в качестве метки для выявления комплементарной последовательности ДНК или мРНК. Зонды для определения мРНК могут быть использованы для выявления синтеза какого-либо специфического белка, который слишком лабилен или выводится из клетки слишком быстро, чтобы его можно было определить иммуногистохимически. Другие пробы могут быть направлены на выявление вирусной ДНК в клетках или для исследования геномной ДНК.

Таблица 4.15. Определение Y-хромосомы методом гибридизации ДНК in situ

1. Разведите биотинированную пробу примерно до I мкг/мл в 50%-ном (объем на объем) формамиде, содержащем 10% (объем на объем) декстран сульфата, 2XSSC, 0,1 мМ ЭДТА, 0,05 мМ Трис-HCl, рН

90