для различных длин волн.

3.5. Объективы и окуляры

При эпиосвещении объектив микроскопа служит также и конденсором; таким образом, получающийся результат сильно зависит от выбора объектива. Не все объективы пригодны для флуоресценции, так как для коррекции аберраций изображения они могут иметь множество дополнительных линз. Пригодны для наблюдения флуоресценции ахроматы и флюоритовые объективы. При работе в проходящем свете интенсивность наблюдаемой флуоресценции пропорциональна квадрату ЧИСЛО-БОЙ апертуры (NA) как объектива, так и конденсора, а при работе в падающем свете — четвертой степени апертуры объектива. Яркость связана обратной зависимостью с увеличением объектива. Таким образом, при флуоресцентной микроскопии желательно пользоваться объективами с высокой числовой апертурой и умеренным общим увеличением.

Таблица 6.2. Типовые комбинации светофильтров

4. Применение флуоресцентных красителей

4.1. Нуклеиновые кислоты

Описано очень много способов окрашивания, позволяющих получить флуоресценцию структур, содержащих нуклеиновые кислоты. Вероятно, одним из самых известных флуорохромов для выявления нуклеиновых кислот является акридиновый оранжевый [21, 22]. Механизм реакции окрашивания сложен. Он включает встраивание молекул красителя в нуклеиновую кислоту и электростатическое связывание. Акридиновый оранжевый может быть возбужден синим светом, и тогда ДНК обычно флуоресцирует зеленым, а РНК — красным светом [23]. Для проточной цитофотометрии часто используют этидиумбромид и пропидиумиодид. Оба они дают красную флуоресценцию при возбуждении синим или зеленым (этидиумбромид) и зеленым (пропидиумиодид) светом.

Другой, часто используемый для окраски ядра флуорохром — это ДАФИ (4',6'-диамидино-2-фенилиндол). Он легко доступен и выпускается, например фирмой Sigma. ДАФИ используется в концентрации 30—1000 нг/мл буфера (0,1 М NaCl, 10 мМ ЭДТА, 10 мМ Трис, рН 7,0). При возбуждении УФ-светом (табл. 6.2) с длиной волны около 350 нм ДАФИ, связанный с ДНК, дает синее свечение с длиной волны около 450 нм. Его можно использовать для окрашивания ядерного материала как in situ, так и при флуоресцентной спектрофотометрии в биохимии [24, 25].

В случае применения для окраски белков ДАФИ дает бело-синюю флуоресценцию при возбуждении УФсветом. Окрашенная ДАФИ цитоплазма ярко флуоресцирует, однако мы наблюдали быстрое снижение интенсивности свечения при освещении. В то же время окрашенная СИТЦ (стильбенизотиоцианатсульфоновая кислота) цитоплазма также дает при возбуждении УФ-светом синюю флуоресценцию, которая не выцветает в такой степени, как свечение после окраски ДАФИ.

Процедуры окрашивания по типу реакции Фёльгена, такие как парарозанилин — Фёльген или акрифлавин

— Фёльген, в основном применяются для получения поглощающих свет окрасок. Однако при использовании специально подобранных длин волн возбуждения, окрашенные парарозанилином ядра могут давать достаточно сильную красную флуоресценцию (при возбуждении зеленым светом). Ядра, окрашенные акрифлавином, демонстрируют при возбуждении синим светом желтую флуоресценцию.

4.1.1. Прижизненное окрашивание флуорохромами

Для создания контраста при флуоресцентной микроскопии требуются очень низкие концентрации красителей, что позволяет использовать для визуализации живых клеток такие вещества, как акридиновый оранжевый. Некоторые компоненты клеток обладают собственной флуоресценцией, и в комбинации с красителем это может давать полезную информацию. Пример такого окрашивания приведен в табл. 6.3.

122