Некоторые фирмы выпускают для фотомикрографии специальные линзы (они не являются окулярами, так как их нельзя использовать для визуальных наблюдений). Эти линзы служат для того, чтобы фотографировать при оптимальной настройке микроскопа (рис. 3.2,Г). К указанной категории относятся и встроенные в большие фотомикроскопы проекционные линзы.
Наконец, многие системы для фотомикрографии имитируют действие глаза с помощью установленной над окуляром дополнительной собирающей линзы, которая формирует действительное изображение (рис. 3.2, Д). Хотя кажется логичным иметь минимум стеклянных поверхностей между микроскопом и пленкой (как на рис. 3.2,В и Г), тем не менее на практике все поступающие в продажу сложные системы дают отличные результаты.
4.4. Освещение
Правильная установка освещения по Кёлеру, описанная в гл. 1, для фотомикрографии еще более необходима, чем для визуального наблюдения, так как пленка не может «исправлять» дефекты изображения подобно тому, как это делает глаз, а потому они будут заметны. Данная система освещения и была разработана специально для фотомикрографии, с целью получить равномерное освещение поля, когда из-за структуры нити накаливания источник дает неравномерное освещение. При правильной установке поле освещено равномерно, при этом полевая диафрагма ограничивает величину освещаемого участка, а апертурная диафрагма определяет угол конуса падающего света, что позволяет привести его в соответствие с апертурой используемого объектива. Для фотомикрографии особенно важно, чтобы никакие поверхности, на которых может оседать пыль, не лежали в плоскости, сопряженной с плоскостью конечного изображения. Это обычно реализуется в правильно изготовленных и настроенных системах. При неправильной настройке системы освещения разрешающая способность снижается, изображение ухудшается за счет рассеянного света, не удается получить равномерного освещения поля зрения, а иногда в конечное изображение попадают нить лампы или частицы пыли.
В некоторых осветительных системах, для того чтобы нить лампы не попадала в изображение, ставится рассеиватель (постоянный или откидывающийся), представляющий собой матовую стеклянную пластинку. Следует помнить, что когда рассеиватель введен в ход лучей, невозможно увидеть нить лампы, даже в том случае, если она должна быть видна при правильной установке освещения по Кёлеру. Мнения относительно того, не ухудшает ли рассеиватель изображение, расходятся. Можно лишь отметить, что он бывает полезен при использовании объективов с малым увеличением. Дело в том, что объективы с малой числовой апертурой обладают большой глубиной резкости, и, таким образом, они могут вводить в изображение расположенную вне фокуса нить лампы даже в тех случаях, когда освещение установлено правильно. В зависимости от положения рассеивателя бывает необходимо иногда немного расфокусировать конденсор, чтобы гранулярная структура поверхности рассеивателя не попадала в изображение.
5. Микроскоп для фотомикрографии
В принципе для фотомикрографии подходит любой микроскоп. Однако, если есть возможность выбора, следует обратить внимание на некоторые детали, которые позволят получать хорошие результаты постоянно и с небольшими затратами сил.
5.1. Штатив микроскопа
Лучше использовать микроскоп с неподвижным тубусом. К счастью, большинство современных микроскопов имеют специальную систему, поддерживающую фотомикрографическую камеру. В случае, если приходится работать с микроскопом, у которого тубус подвижен, следует тщательно проверять, что от момента наведения на резкость до окончания экспозиции его фокусировка не меняется. Изменение может происходить под действием веса камеры. В большинстве микроскопов есть возможность регулировать усилие, необходимое для поворота макровинта, перемещающего тубус. Для фотографии его можно затянуть, вращая винты фокусировки, расположенные с двух, сторон станины, в противоположных направлениях.
Очень полезно иметь столик с системой механического перемещения препарата, позволяющий точно кадрировать изображение. В тех случаях, когда вращение фотокамеры невозможно или затруднено, полезен вращающийся предметный столик, который позволяет наилучшим образом выставить изображение в прямоугольный кадр.
Простейшие адаптеры для фотокамер могут быть установлены непосредственно на окулярный тубус, имеющий почти стандартный диаметр, однако желательно не пользоваться наклонными тубусами. Идеальным для установки камеры является тройной (тринокулярный) тубус, состоящий из нормального бинокулярного тубуса, используемого для наблюдения,, и вертикального фототубуса, в который с помощью светоделительной призмы полностью или частично направляется формирующий изображение свет.
В последние годы были созданы большие фотомикроскопы со встроенными фотосистемами. Эти приборы, содержащие микроскоп и фотографическую часть, описаны в разд. 6.4.
5.2. Оптика
Фотомикрографии хорошего качества нельзя получить с помощью плохой оптической системы. Решающим
47
является качество объектива, кроме того, важно использовать подходящие окуляры или проекционные линзы; использование хорошо исправленного конденсора также заметно сказывается на качестве конечного изображения.
5.2.1. Числовая апертура и увеличение объективов
Как отмечалось ранее в разд. 4.1 гл. 1, чем больше NA объектива, тем более мелкие детали он может разрешать. Если посмотреть на паспортные данные объективов, то можно видеть, что увеличение и апертура не связаны строго между собой. Так, например, существуют объективы 40/0,65; 40/1,3 и 100/1,3. Первые два дают изображения, сходные по размерам,, однако второй позволяет различить более мелкие детали. Два последних объектива, масляно-иммерсионные, имеют одинаковое разрешение, но объектив 40 позволяет наблюдать большую площадь препарата (при меньшем увеличении) по сравнению с объективом 100.
Объективы следует выбирать, исходя, главным образом, из их апертуры, а следовательно, из разрешающей способности, а не из увеличения. В настоящее время многие микроскопы снабжены системами переменного увеличения, которые позволяют изменять конечное увеличение приблизительно вдвое. Кроме того, при печати можно давать дополнительное фотоувеличение. Из трех упомянутых выше объективов при прочих равных характеристиках автор рекомендовал бы для получения качественных фотомикрографий объектив 40/1,3.
5.2.2. Исправление аберраций
Объективы для микроскопов подразделяются на несколько типов в зависимости от степени исправления хроматической и сферической аберраций. Эти типы можно в свою очередь подразделить в соответствии с тем, насколько объективы свободны от кривизны поля зрения, каковы их увеличение и числовая апертура, являются ли они сухими или иммерсионными.
Простейшие объективы — это ахроматы, которые сводят синие и красные лучи в один фокус, несколько отличающийся от фокуса для зеленого света. Даваемое ими изображение может иметь слабо заметные цветные кольца, окрашенные в зависимости от фокусировки в зеленый или пурпурный цвет. Ахроматы исправлены в отношении сферической аберрации только для зеленых лучей. Они сравнительно дешевы и пригодны для визуальных наблюдений. Для фотомикрографии их следует использовать по возможности вместе с монохроматическим зеленым светофильтром (например, Wratten 58 фирмы Kodak) или интерференционным зеленым фильтром. Тогда они дают сравнительно хорошие результаты.
Флюоритовые объективы (названные так потому, что в них стоят линзы из минерала флюорита), или полуапохроматы, лучше исправлены в отношении хроматической аберрации, чем ахроматы. Благодаря этому они выпускаются с относительно большей (при данном увеличении) апертурой и дают более качественное и контрастное изображение. Простота конструкции и большая светосила делают флюоритовые объективы удобными для флуоресцентной микроскопии. Они также могут быть с успехом использованы для фотомикрографии.
Апохроматы представляют собой наиболее скорректированные объективы, у которых практически полностью исправлена хроматическая аберрация, а сферическая аберрация исправлена не для одного, а для двух цветов. Эти объективы дают высококачественное изображение и более всего подходят для качественной фотомикрографии, особенно в цвете. Такие объективы сложны в изготовлении, поэтому в микроскопах многих фирм добиваются коррекции вторичной хроматической аберрации с помощью специальных «компенсационных» окуляров. По этой причине полностью исправленная система состоит из объектива и соответствующего окуляра. Для объективов, изготовленных различными фирмами, а иногда и для разных объективов, выпускаемых одной фирмой, нужны различные окуляры. В некоторых случаях полная коррекция аберраций проведена в самом объективе. Обычно практикуемая в лабораториях беспорядочная замена оптических элементов, очевидно, не может дать хороших результатов. Если нет уверенности в целесообразности той или иной замены, то следует обратиться к инструкциям изготовителя.
5.2.3. Сухие объективы и толщина покровного стекла
Объективы рассчитаны на то, чтобы наблюдать препарат через материал определенной толщины и с определенным показателем преломления, и чем больше апертура объектива, тем важнее соблюдать данные условия. Если использовать объектив не так, как рекомендуется, то качество изображения ухудшится из-за неполной коррекции сферической аберрации. Для большинства сухих объективов (то есть рассчитанных на воздушную прослойку между препаратом и фронтальной линзой) требуется покровное стекло «№ Р/2» толщиной 0,17 мм, и последнее число выгравировано на их оправе. Некоторые объективы, маркированные Эпи (Epi), 0, или просто «—», рассчитаны на работу с непокрытым препаратом, другие, наоборот, могут быть использованы при работе с культуральными флаконами и рассчитаны на толщину их стенок до 2 мм.
В некоторых специальных случаях, например в цитогенетике, используются препараты без покровных стекол (гл.9). Для наблюдения таких препаратов может быть с успехом использован объектив Zeiss Epiplan 80/0,95, который более известен среди специалистов по материаловедению, нежели среди биологов.
Небольшие отклонения в толщине покровного стекла, как правило, несущественны для объективов с апертурой менее 0,65, но имеют значение для сухих объективов с большой апертурой (0,75—0,95). Эти объективы часто имеют коррекционную оправу, которая позволяет добиваться максимальной коррекции
48
сферической аберрации за счет изменения расстояния между линзами объектива. Даже при использовании покровного стекла нужной толщины может потребоваться коррекция на дополнительную толщину, создаваемую заливочной средой.
Для получения наилучших результатов следует применять покровное стекло нужной толщины, обычно 0,17 мм, и использовать минимальное количество заливочной среды. При работе со срезами последние лучше по возможности монтировать непосредственно на задней поверхности покровного стекла.
Рис. 3.3. Правильная установка коррекционной оправы для исправления сферической аберрации на объективе 40/0,95. Условия печати обеих фотографий были идентичны. А. Правильная установка коррекции на толщину покровного стекла 0,17 мм. Б. Неправильная установка, коррекция сделана на толщину стекла 0,23 мм, ошибка в 0,05 мм (50 мкм) в толщине покровного стекла или заливочной среды. Шкала 50 мкм.
Для правильной установки коррекционной оправы объектива:
1)сфокусируйте изображение препарата;
2)поверните немного коррекционную оправу и расфокусируйте изображение;
3)убедитесь в том, что контраст изображения увеличился;
4)если это так, то продолжайте поворачивать оправу в туже сторону, каждый раз наводя на фокус;
5)когда изображение начнет расплываться, поворачивайте оправу назад до тех пор, пока не найдете ее наилучшее положение.
Необходимость правильной установки коррекционной оправы иллюстрирует рис. 3.3. В случае, когда препарат сделан с использованием слишком толстого покровного стекла или содержит слишком толстый слой заливочной среды, необходимо воспользоваться иммерсионным объективом (разд. 5.2.4).
5.2.4. Иммерсионные объективы
Иммерсионные объективы необходимо использовать в тех случаях, когда нужна апертура 1,0 и более. Большинство иммерсионных объективов рассчитаны на работу со специально изготовленным маслом. Кроме того, имеются объективы для работы с водной и с глицериновой иммерсией, а также объективы, настраиваемые для работы с любой иммерсионной средой.
Хотя обычно при визуальной микроскопии стремятся избежать применения иммерсионных объективов, для фотомикрографии эти объективы имеют большие преимущества. Помимо большой апертуры и, следовательно, высокого качества изображения, использование иммерсионных объективов, особенно масляной иммерсии, позволяет полностью избежать описанных выше трудностей, связанных с неправильной толщиной покровного стекла. Поскольку оптические свойства заливочной среды, покровного стекла и иммерсионного масла близки, то большая или меньшая толщина одного слоя по сравнению с другим не приводит к искажениям. Поэтому при фотомикрографии значительно лучше использовать иммерсионный объектив 40/1,0. а не сухой 40/0,95.
Поскольку иммерсионные масла несколько различаются, то при их применении следует руководствоваться рекомендациями фирмы-изготовителя оптики. Особенно важно избегать смешения различных масел. Если на объективе остались следы масла, то при использовании другого масла качество изображения может ухудшиться. Чистка линз объективов рассматривается в разд. 5.2.8.
5.2.5. Глубина резкости
Глубина резкости есть расстояние в объекте по оптической оси микроскопа, вдоль которой все детали выглядят резкими. Глубина резкости уменьшается с увеличением апертуры; высокоапертурные объективы имеют глубину резкости менее 1 мкм, и, таким образом, только малая часть препарата оказывается в фокусе в каждый данный момент наблюдения. Поскольку резко изображаемая часть оказывается значительно меньше толщины препарата или даже среза, то для одного участка можно получить серию «оптических срезов». Именно поэтому опытный микроскопист, рассматривая препарат, постоянно меняет фокусировку микровинтом.
При фотомикрографии для каждого кадра должен быть выбран один план, поэтому для исследования важных и сложных образцов лучше делать серию фотографий последовательных оптических срезов.
Конечно, можно воспользоваться объективом с меньшей апертурой и соответственно с большей глубиной резкости, однако при этом пострадает разрешение и соответственно уменьшится полезное увеличение. В традиционной световой микроскопии противоречие между большой апертурой, дающей высокое разрешение, и
49
малой глубиной резкости является непреодолимым. Тем не менее следует помнить, что, если при фотографировании препаратов требуется большая глубина резкости, разрешение может уменьшаться за счет других факторов, например за счет толщины самого препарата, и тогда нет необходимости в применении объективов с большой апертурой.
5.2.6. Кривизна поля зрения
Многие объективы дают изображение, в котором центральная часть и периферия не могут быть сфокусированы одновременно. При визуальной микроскопии это не является помехой, однако для фотомикрографии такие изображения непригодны. Данная проблема не очень существенна, если используются сравнительно толстые срезы, поскольку кривизна поля зрения приводит лишь к тому, что резкими оказываются детали, лежащие на разных уровнях, но в случае тонких срезов, которые все чаще используются в настоящее время, эти изображения непригодны для фотомикрографии.
Чтобы решить данную проблему, фирмы-изготовители выпускают специальные объективы с минимальной кривизной поля зрения, которые отмечены приставкой «План» (Plan), например Планахромат и Планапохромат. План-объективы специально рекомендуются для фотомикрографии, и их следует всегда использовать с окулярами, рекомендуемыми фирмой-изготовителем.
5.2.7. Типы конденсоров
Для фотомикрографии рекомендуются конденсоры с наиболее полно исправленными сферической и хроматической аберрациями. За счет своего высокого качества они обеспечивают большую точность настройки, более высокий контраст (благодаря уменьшению количества рассеянного света) и более равномерное освещение поля зрения. Эти преимущества особенно заметны при цветной фотомикрографии.
Типы конденсоров варьируют от простейших двухлинзовых типа Аббе, неисправленных в отношении сферической и хроматической аберраций, и апланатических, исправленных в отношении сферической аберрации, до апланатических ахроматических, исправленных в отношении сферической и хроматической аберраций и дающих наилучшие результаты. Из-за аберраций простейшие конденсоры дают нерезкое, имеющее цветную кайму изображение полевой диафрагмы, что не позволяет точно установить освещение по Кёлеру. Более того, из-за своей ограниченной апертуры они не могут дать необходимого освещения для объективов с большой апертурой, что не позволяет полностью воспользоваться потенциальной разрешающей способностью последних.
Наиболее исправленные конденсоры, как правило, рассчитаны на то, что при использовании апертуры 1,0 и больших апертур между их фронтальной линзой и предметным стеклом наносится иммерсионное масло. Применение иммерсии на конденсоре, хотя она и загрязняет его, рекомендуется для получения наилучших результатов при фотомикрографии с использованием высокоапертурных объективов.
При использовании объективов с малым увеличением (как правило, меньше 10) могут возникнуть трудности с освещением всего большого поля зрения с помощью стандартных конденсоров. Эта проблема часто вынуждает микроскопистов совершать одну из самых существенных ошибок в микроскопии, а именно опускать конденсор ниже правильного положения, снижая тем самым качество изображения. Для работы с объективами малого увеличения некоторые конденсоры снабжены откидывающейся верхней линзой, а у некоторых микроскопов имеется дополнительная линза, размещаемая под конденсором. В других микроскопах есть дополнительные линзы между коллектором и конденсором, расположенные в основании станины микроскопа. Все указанные системы служат для увеличения изображения полевой диафрагмы, создаваемого конденсором в плоскости образца. Так, конденсор, имеющийся у автора, освещает в плоскости препарата пятно диаметром 1,5 мм, если верхняя линза введена в ход лучей, и пятно диаметром 5 мм при откинутой линзе. В случаях, когда верхняя линза не откидывается, того же эффекта можно достичь, вывернув ее. Если фотомикрография на малом увеличении применяется в лаборатории постоянно, то желательно иметь специальный длиннофокусный конденсор.
5.2.8. Чистка линз
Наилучший способ иметь чистые линзы — это предохранять их от загрязнения. Многие оптические стекла значительно мягче, чем оконное стекло, и их просветляющее покрытие очень чувствительно к абразивам. Поэтому чистка оптических поверхностей неизбежно сопряжена с риском повредить полировку линз. В связи с этим можно дать ряд полезных советов:
1)все оптические элементы, когда они не используются, должны быть закрыты. При использовании даже простейшего полиэтиленового чехла потребность в очистке значительно уменьшается;
2)следует очень внимательно следить за тем, чтобы при смене препаратов иммерсия не попала на сухие объективы;
3)следует избегать загрязнений канадским бальзамом и другими заливочными средами со свежеприготовленных препаратов. Их очень трудно удалить, особенно после того, как они застынут;
4)никогда не ставьте иммерсионный объектив на стол «вверх ногами», не удалив предварительно с него все масло, которое может затечь внутрь объектива;
5)никогда не разбирайте объектив для чистки самостоятельно. До тех пор, пока вы не достигнете
50