пероксидазой антикроличьи антитела свиньи (Dakopatts), также использованные в разведении 1 : 100. Для цветной окраски использовали диаминобензидин (ДАВ), а для дополнительной окраски — гемалаун Майера (разд. 6.9.2). Срезы заключали под покровные стекла, используя DPX (разд. 6.9.3), Антитела избирательно связываются с астроцитами, а тонкие фибриллы, являющиеся клеточными отростками, окрашиваются гемалауном. На срезе, предварительно обработанном проназой, можно видеть более интенсивную окраску.

Рис. 4.2. Мозжечок человека, окрашенный на глиальный фибриллярный кислый белок. Показан эффект предварительной обработки протеазой (см. текст). Шкала — 30 мкм.

Таблица 4.5. Метод обработки срезов проназой

Метод применяется для срезов ткани, фиксированной до окраски первыми антителами.

1.Распарафинировать срезы и провести их по спиртам со снижающимися концентрациями до воды.

2.Проинкубировать срезы в ФСБ при 37 °С в течение 5 мин.

3.Проинкубировать срезы в ФСБ с проназой (50 мг/мл) при 37 °С в течение 20 мин.

4.Отмывать в проточной воде в течение 5 мин.

5.Дважды промыть в ФСБ.

6.Окрашивать антисывороткой согласно требуемой методике.

После такого воздействия срезы становятся очень хрупкими и требуют особой осторожности при обращении с ними.

4. Выбор способа мечения

Метки, используемые для визуального выявления антител делятся на три класса: флуоресцентные метки, ферментные метки и метки, в состав которых входит золото (такую метку можно усилить серебром). Возможно также использование радиоактивной метки, с последующей радиоавтографией. Метод радиоавтографии не является обычной иммуногистохимической процедурой, и поэтому он не будет здесь рассматриваться.

4.1. Флуоресцентные метки

Идеальная флуоресцентная метка характеризуется высоким квантовым выходом, а также тем, что длины волн возбуждения и испускания достаточно различаются. При этом максимум поглощения должен находиться вблизи мощной линии свечения дуговой ртутной лампы (которая обычно используется во флуоресцентной микроскопии), а длина волны испускаемого -света должна быть приемлема одновременно и для человеческого глаза, и для фотографической пленки. На практике в качестве флуоресцентных меток обычно используются два вещества — флуоресцеин и родамин. Оба они могут присоединяться к белковой молекуле посредством реакции связывания лизиновых остатков с изотиоцианатом (табл. 4.6). Все фирмы — изготовители флуоресцетных микроскопов выпускают светофильтры, рассчитанные на данные соединения. Недавно во флуоресцентной

76