Рис. 9.7. Флуоресценция хромосом из лимфоцита женщины после окраски дистамицином — ДАФИ. Ярко флуоресцирует только гетерохроматин в хромосомах 1, 9, 15 и 16 (указан стрелками), в мужских клетках гетерохроматин в Y-хромосоме также будет ярко флуоресцировать. Микрография любезно предоставлена Г, Сповартом (G. Spowart). Воспроизводится по Sam-пег, А.

Т. (1983), Science Progress, 68, p.p. 543— 564.

Дистамицин А нестабилен в растворе, так что лучше готовить свежий раствор по мере необходимости. ДАФИ стабилен в растворе и может храниться в холодильнике по крайней мере несколько недель. Можно сделать концентрированный раствор ДАФИ: 0,5 мг/мл в дистиллированной воде, и разводить его буфером Маклвейна, как указано выше. Вместо ДАФИ и дистамицина могут быть использованы другие вещества, дающие сходные результаты. Одним из наиболее распространенных заменителей является метиловый зеленый, который значительно дешевле заменяемого им дистамицина [31]. Вместо ДАФИ может использоваться Хёхст

33258 (Sigma) [32].

5.2. Дифференциальное окрашивание реплицирующихся участков хромосом

Данный метод используется для выявления тех участков хромосом, которые реплицируются в ранней или поздней S-фазе. Получаемые рисунки сегментации напоминают таковые при G- или R-окрашивании в зависимости от того, какие выявляются участки — рано или поздно реплицирующиеся. Иногда однако наблюдаются небольшие различия, например, с помощью данного метода можно отличить поздно реплицирующуюся X-хромосому самок млекопитающих от той же рано реплицирующейся [33] хромосомы, при этом характер сегментации может существенно варьировать.

Реплицирующуюся ДНК метят путем включения в нее 5-бромурацилдезоксирибозида (БУДР), который вводится в культуру в нужное время. После стандартной фиксации культивируемых клеток ДНК с включенным БУДР может быть дифференциально окрашена. Для этой цели обычно используют FPG-метод («флуоресценция плюс краситель Гимза»), который дает неплохие результаты [35]. При его применении сегменты хромосом, содержащие БУДР, остаются бледными, а немеченные сегменты интенсивно окрашиваются.

Вся методика выявления реплицирующихся сегментов состоит из двух частей: культивирования клеток и окрашивания. Последняя является стандартной, а методика культивирования должна быть подобрана в соответствии с тем, какие сегменты (рано или поздно реплицирующиеся) необходимо выявить и на какой стадии клеточного цикла находятся клетки, которые предполагается исследовать.

5.2.1. Метод культивирования клеток

Описываемые здесь процедуры были разработаны для лимфоцитов человека [34]. Культивирование ведется стандартным способом [11] за исключением того, что к клеткам добавляется БУДР и некоторые другие вещества. Они добавляются в культуральную среду в следующих концентрациях:

При добавлении ФУДР и дезоксиуридина стимулируется включение БУДР в ДНК, однако удовлетворительные результаты можно получить и без применения этих веществ.

Для выявления поздно реплицирующихся участков БУДР л другие вещества добавляются в самом начале культивирования.

Затем за 5—7 часов до фиксации культуры культуральную среду меняют и клетки переносят в стандартную среду, куда добавляют 6Х10~4 М дезокситимидина. Этот прием получил название «Т-импульсное мечение». При таком мечении поздно реплицирующаяся ДНК не содержит БУДР.

Для выявления рано реплицирующихся участков клетки выращивают в стандартной среде, а за 5—7 часов до фиксации к ним добавляют в указанных выше концентрациях БУДР, ФУДР, дезоксиуридин и дезоксицитидин. Этот прием называется «В-импульсное мечение». В результате в поздно реплицирующуюся ДНК БУДР включается, а в рано реплицирующуюся — нет. БУДР чувствителен к свету, поэтому исходный концентрированный раствор и культуры, куда добавлен БУДР, надо хранить по возможности в темноте. Для более детального ознакомления с методикой культивирования клеток в присутствии БУДР см. [32] и [34].

203

5.2.2. Методика окраски

Меченные БУДР хромосомы дифференциально окрашивают по методу FPG [35].

1.Окрасьте препарат фиксированных хромосом в течение 12— 15 мин в растворе Хёхст 33258 (Sigma; концентрация 0,5 мкг/мл в деионизованной воде).

2.Промойте стекла деионизованной водой.

3.Заключите препарат хромосом в деионизованную воду, замажьте края стекла резиновым клеем и оставьте при дневном свете на 24 часа.

4.Снимите покровные стекла.

5.Проинкубируйте препарат 2 часа при 60 °С в растворе 2 х SSC (0,3 М хлористый натрий плюс 0,03 М тринатрий-цитрат).

6.Окрасьте препарат в течение 30 мин в 3%-ном растворе красителя Гимза (модификация Гарра, R66) при рН 6,8 (буфер Гарра в таблетках).

7.Промокните стекла, дайте им высохнуть и заключите в DРХ. Результаты такого окрашивания показаны на рис. 9.8. Рано реплицирующиеся области хромосом имеют темную окраску, а поздно реплицирующиеся области (включая всю Х-хромосому) окрашены слабо. Таким образом, данная клетка в культуре получила В- импульсную метку.

Для того чтобы получать препараты более быстро и иметь больше возможностей для регулирования процесса окраски, чем в приведенном выше протоколе, дневной свет можно заменить искусственным [32]. Продолжительность засветки зависит от типа применяемой лампы и определяется эмпирически. Однажды определенная, эта продолжительность должна быть в дальнейшем примерно одной и той же при условии, разумеется, что расстояние от лампы до стекол с препаратами постоянное поскольку краситель Хёхст 33258 поглощает ультрафиолет, то наибольший эффект даст лампа, имеющая сравнительно большой световой поток в диапазоне ближнего УФ-света.

Рис. 9.8. Дифференциальное окрашивание реплицирующегося хроматина в хромосомах женщины. ДНК в этих клетках была обработана БУДР в конце S-фазы (В-импульсная метка), так что после FPG-окрашивания поздно реплицирующиеся районы хромосом оказались бледными. Обратите внимание на поздно реплицировавшуюся Х-хромосому (указана стрелкой) Препарат любезно предоставила К, Е. Бактон (К. Е. Buckton). Воспроизводится поSamner, А. Т. (1983), Science Progress, 68, p.p. 543—564.

Включение БУДР в хромосомную ДНК с последующей окраской методом FPG может быть использовано не только для изучения реплицирующихся сегментов, но также и для исследований сестринских обменов [36] и латеральной асимметрии гетерохроматина [37]. Последние задачи требуют включения бромдезоксиуридина в течение большого промежутка времени, за который метка включилась бы в одну хроматиду по всей ее длине (в случае, когда требуется дифференциальное окрашивание сестринских хроматид). Однако собственно методика окрашивания аналогична описанной выше за исключением времени обработки клеток в культуре.

5.3. Дифференциальное окрашивание с высоким разрешением

Стандартный кариотип метафазных хромосом человека содержит в расчете на гаплоидный набор около 300 сегментов. С помощью различных методов можно получить более длинные хромосомы, на которых выявляется большее число сегментов, что дает возможность определять делеции меньших размеров и более точно находить места разрывов в хромосомах. В настоящее время достигнут результат в 2000 сегментов на гаплоидный набор, однако обычно методами, получившими общее название «сегментирование с высоким разрешением» (HRB, от англ, high resolution banding), удается получить 500—800 полос.

Методы получения HRB можно разделить на две категории, которые однако не являются взаимоисключающими. В обоих случаях культивируемые клетки обрабатывают соответствующими реагентами. Целью обработок является синхронизация клеток в профазе или подавление конденсации хромосом. Ясно, что некоторые из используемых веществ могут в той или иной степени вызывать оба указанных эффекта. Поскольку ни одно из применяемых для HRB веществ не задерживает клетки в профазе подобно тому, как колхицин и его аналоги блокируют митоз на стадии метафазы, необходимо предварительно каким-либо способом синхронизировать клетки. С этой целью в них часто блокируют синтез ДНК, в результате чего накапливаются клетки, находящиеся в начале S-фазы. После замены культуральной среды на среду без ингибитора в клетках одновременно начинается репликация ДНК и их можно взять для эксперимента через

204

определенный интервал времени, когда они вступят в профазу. Важнейшим условием для получения хороших результатов является правильный выбор времени фиксации. Методы с использованием веществ, подавляющих конденсацию хромосом, являются сравнительно простыми: данные вещества просто добавляются в культуральную среду в подходящих концентрациях.

Ни один из опубликованных до настоящего времени методов не является универсальным, поэтому вместо того чтобы давать здесь детальное описание методов, мы перечислим основные из них и дадим соответствующие ссылки. Для каждого исследуемого материала нужно экспериментально подобрать наиболее эффективный метод.

5.3.1. Синхронизация клеток с помощью метотрексата [38]

До введения метотрексата (аметоптерин; Sigma), блокирующего синтез ДНК, клетки культивируют в течение определенного периода времени. Ингибирование метотрексатом снимается путем помещения клеток в свежую среду, содержащую тимидин, где они растут в течение нескольких часов, пока не достигнут профазы. Харрисоном [13] описана модификация данного метода для клеток костного мозга. Препарат хромосом, полученный в результате синхронизации метотрексатом, может быть с успехом дифференциально окрашен с помощью одного красителя Райта.

5.3.2. Синхронизация с помощью БУДР [39]

Это по существу такой же способ синхронизации, как описанный выше (разд. 5.3.1), но вместо метотрексата используется БУДР (Sigma). Однако надо отметить, что помимо способности синхронизировать клетки БУДР обладает еще одним ценным свойством — он подавляет конденсацию хромосом. После обработки этим веществом можно применять различные методы дифференциального окрашивания, например ASG-метод (разд. 4.2.1) или R-окраску (разд. 4.3). Поскольку БУДР во время обработки включается в ДНК, для получения сегментов может быть использован FPG-метод [35] (разд. 5.2).

5.3.3. Синхронизация с помощью ФУДР [13, 40]

Фторурацилдезоксирибозид (Sigma) используется так же, как и метотрексат. Первый, однако, имеет то преимущество, что блокирование синтеза ДНК, которое он вызывает, можно снять просто добавлением тимидина, и тогда репликация ДНК начинается в присутствии ФУДР. После такой обработки можно применять стандартные методы дифференциального окрашивания. Кроме тимидина для снятия блока можно использовать БУДР и краситель Хёхст 33258, что приводит к включению БУДР в состав хромосомной ДНК и позволяет применить для окрашивания FPG-метод [35]. Оба вещества, и БУДР, и Хёхст 33258, ингибируют конденсацию хромосом.

5.3.4. Ингибирование конденсации хромосом с помощью меркаптоэтанола [41]

Лимфоциты культивируют обычным способом, но в конце культивирования клетки обрабатывают в течение 10 мин при 37 °С гипотоническим раствором, содержащим 0,075 М КС1 и 0,075 М 2-меркаптоэтанола. Затем на 10 мин добавляют колцемид, после чего хромосомные препараты изготавливаются обычным способом (разд. 3). Хромосомы могут быть дифференциально окрашены с помощью метода Гимза с обработкой трипсином (разд. 4.2.2) или акрихином (разд. 4.4).

5.3.5. Ингибирование конденсации хромосом с помощью этидиумбромида [42]

Перед фиксацией стандартную культуру лимфоцитов человека инкубируют в течение 2 часов с этидиумбромидом (фирма ВОН) в концентрации 5—10 мкг/мл и колцемидом в концентрации 0,02 мкг/мл. Гипотоническую обработку, фиксацию и получение препаратов расправленных хромосом производят стандартным методом (разд. 3), а окрашивание для выявления G-сегментов производится с помощью метода Гимза с обработкой трипсином (разд. 4.2.2). Этим способом также можно получить удовлетворительную окраску Q-сегментов (разд. 4.4).

Результаты окрашивания хромосом человека HRB-методом представлены на рис. 9.9. На нем одновременно видны преимущества и недостатки HRB-метода. Хотя с помощью данного метода выявляется значительно больше сегментов, чем при простом дифференциальном окрашивании метафазных хромосом, однако многие детали трудно различить. Рисунок сегментации хромосом виден недостаточно четко, что затрудняет их идентификацию, а поскольку сегментов много, то вполне можно допустить, что различия между гомологами объясняются только техническими причинами. Для проверки того, существуют ли различия между гомологами в действительности, необходимо просмотреть большое число препаратов расправленных хромосом. Другая проблема состоит в том, что в результате удлинения хромосом увеличивается вероятность их наложения друг на друга в препарате. Тем не менее, HRB-метод уже хорошо зарекомендовал себя при идентификации маленьких делеций в хромосомах, особенно в раковых клетках.

5.4. Мечение кинетохоров с помощью сыворотки больных CREST-синдромом

Опубликованные методы окрашивания кинетохоров хромосом красителем Гимза или серебром не дают

205

очень хороших результатов. В то же время сыворотка больных аутоиммунным заболеванием, CRESTвариантом склеродермии, содержит антитела, специфически реагирующие с кинетохорами [7]. Предлагаемый ниже метод иммуноцитохимического выявления кинетохоров с помощью данной сыворотки не может быть рекомендован в качестве стандартного по следующим причинам:

1)поскольку кинетохорный антиген очень лабилен, для его выявления не годятся стандартные препараты хромосом, зафиксированных смесью метанол—уксусная кислота;

2)необходимая для данного метода аутоиммунная сыворотка больных CREST-синдромом не является широкодоступной и не поставляется коммерческим путем;

3)различные образцы сыворотки обладают сродством к разным кинетохорным антигенам и могут также связываться с другими, некинетохорными антигенами, что затрудняет интерпретацию результатов;

4)качество получаемых при данной методике препаратов расправленных метафазных хромосом обычно низкое.

Рис. 9.9. Дифференциальное окрашивание хромосом с высоким разрешением. Обратите внимание на наличие гораздо большего по сравнению с метафазными хромосомами (рис. 9.3) количества сегментов. Микрографию любезно предоставил Г. Споварт (G. Spowart). Воспроизводится по

Samner АТ (1983), Science Progress, 68, p.p. 543—564.

Тем не менее данная процедура полезна, особенно для изучения дицентрических хромосом, у которых одна из центромер может иметь активные или «неактивные» (немеченые) кинетохоры.

1.Приготовление хромосомного препарата: клетки культивируют обычным образом и для набухания обрабатывают гипотоническим раствором (разд. 3). Затем, не фиксируя, клетки центрифугируют на центрифуге Cytospin (Shandon Southern Instruments), осаждая их на предметные стекла. После центрифугирования стекла вынимают из центрифуги и дают им высохнуть.

2.Препарат расправленных хромосом фиксируют чистым ацетоном или чистым метанолом в течение 10 мин при -20 °С в морозильнике. После фиксации препараты высушивают.

3.Препарат хромосом инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре с сывороткой больных CREST-синдромом, разведенной ФСБ (раствор А Дальбекко, Oxford Ltd). Образцы CREST-сыворотки можно получить в ревматологическом отделении больницы. Хотя данная сыворотка практически всегда связывается с кинетохорами, она может связываться и с другими клеточными структурами, так что специфичность каждого образца сыворотки необходимо проверять. Оптимальное разведение сыворотки надо подбирать эмпирически. Для начала воспользуйтесь разведением 1 : 500. Нанесите каплю разбавленной сыворотки на препарат хромосом и накройте его покровным стеклом. Затем стекло надо перенести во влажную камеру (пластиковый контейнер подходящих размеров, на дне которого лежит влажная фильтровальная бумага).

4.Промойте стекла в трех сменах ФСБ и стряхните с них избыток жидкости.

5.Проинкубируйте препарат в течение 30 мин при комнатной температуре во влажной камере в капельке меченных ФИТЦ антител против человеческих антител (разведение 1:5 в том же буфере), как указано выше

(этап 3).

6.Промойте стекла в трех сменах ФСБ.

7.Заключите препараты в смесь Citifluor ФСБ (AF3, Citifluor Ltd) и замажьте края покровного стекла резиновым клеем (разд. 4.4.1). Данная заливочная среда специально разработана для того, чтобы замедлять выцветание флуоресцеина.

Хромосомы иногда можно опознать по их слабому неспецифическому свечению, но лучше дополнительно окрасить их каким-нибудь флуорохромом, специфическим для ДНК. Подходящими для этого красителями являются ДАФИ (разд. 5.1), Хёхст 33258 (разд. 5.2) и этидий. Хромосомы можно окрасить в растворе этидиумбромида (10 мг/мл в ФСБ) в течение 5 мин, а затем промыть тем же буфером перед заключением препарата. При применении ДАФИ или Хёхста 33258 флуоресценция ДНК возбуждается ультрафиолетом, так что флуоресценция хромосом и кинетохоров не будет видна одновременно (при использовании одного комплекта светофильтров). Флуоресценция ФИТЦ, как и этидиумбромида, возбуждается синим светом, так что при их использовании хромосомы и кинетохоры видны одновременно (рис. 9.10). Последний способ дает наиболее удовлетворительные результаты, но важно не перекрасить препарат этидиумбромидом, флуоресценция которого может оказаться настолько яркой, что флуоресценция от кинетохоров не будет видна. Для уменьшения общей окраски хромосом можно развести раствор этидиумбромида или уменьшить

206