Таблица 5.19. Метод выявления внутрикостных полостей*

1.Препарат может быть зафиксирован любым фиксатором кроме тех, которые содержат хлорид ртути.

2.Проведите декальцинацию любым стандартным раствором**.

3.Сделайте криостатные срезы или срезы препарата, залитого в нитроцеллюлозу (например в целлоидин).

4.Размочите срезы и, в случае нитроцеллюлозных срезов, убедитесь, что весь этанол удален.

5.Окрасьте срезы раствором тионина *** в течение 5—20 мин.

6.Промойте дистиллированной водой ****.

7.Окрасьте насыщенным водным раствором пикриновой кислоты в концентрации примерно 1,2% (вес на объем) в течение 30—60 сек ****.

8.Промойте дистиллированной водой ****.

9.Отдифференцируйте в 70 %-ном (объем на объем) этаноле до тех пор пока сине-зеленая краска не перестанет выходить из срезов. Обычно на это уходит 5—10 мин.

10.Быстро проведите препараты через растворы спиртов в возрастающих концентрациях, ксилол и заключите в синтетическую смолу.

Результаты. Лакуны и канальцы будут темно-коричнево-черными, матрикс кости — желтым или коричнево-желтым, а клетки — красными.

Возможные трудности. Бели окраска слабая или не видны канальцы, то попытайтесь: а) увеличить время окраски тионином и б) уменьшить время дифференцировки и проводки при обезвоживании. Если окрашиваются также и большие полости, то увеличьте продолжительность промывки на этапе 7.

*Данный метод получил название тионин-пикринового метода Шморля, и он позволяет выявлять различные полости, например в зубах.

**Для декальцинации поместите зафиксированный блок ткани в 7%-ный водный раствор (объем на объем) муравьиной кислоты на 1—10 дней (время зависит от объема блока). Фиксацию и декальцинацию можно проводить одновременно, используя водный раствор формалин — ЭДТА (5,5 г ЭДТА и 10 мл насыщенного формалина в 100 мл воды) в течение нескольких недель.

***Растворите 0,125 г тионина в 100 мл воды. Непосредственно перед употреблением профильтруйте и добавьте одну каплю насыщенного раствора аммония.

****Во время этой процедуры стаканчик необходимо слегка встряхивать.

4. Выбор методов

Биологи обращаются к методам гистохимического окрашивания, когда сталкиваются с одной из следующих проблем.

1.Химическая или биологическая идентификация или характеристика наблюдаемого в микроскоп объекта.

2.Обнаружение и иногда количественное определение химических или биологических свойств исследуемого объекта.

Подходящие гистохимические методы можно выбрать одним из перечисленных ниже способов.

1.Поиск в литературе по гистохимии метода, который точно соответствует поставленной задаче.

2.Поиск в литературе по гистохимии метода, относящегося к очень близкой задаче и поэтому с большой вероятностью подходящего для вашей задачи.

3.Если в литературе не содержится подходящих методов, то нужно сформулировать проблему с точки зрения биологической или химической характеристики, которую можно выявить гистохимическим методом.

Ситуации, описанные в пунктах 1 и 2, будут проиллюстрированы и рассмотрены в следующем разделе, где также приведен пример ситуации, относящейся к пункту 3. Поскольку настоящая глава носит вводный характер, то проблемы, возникающие при разработке новых гистохимических методов, в ней не обсуждаются.

4.1. Выбор методов окрашивания для известных объектов

Поскольку настоящая глава адресована начинающим, незнакомым с гистохимической литературой, то в ней нельзя избежать некоторых излишних для специалиста подробностей. Поэтому подготовленные читатели могут пропустить несколько параграфов.

Ситуация, описанная в пункте 1, лучше всего формулируется следующим образом: найти гистохимический метод, с помощью которого можно выявить данное биологическое или химическое свойство, характерное для данного типа препаратат возможно, с использованием данного вида окрашивания.

Выделенные курсивом слова надо иметь в виду, читая оглавления и указатели соответствующих книг и журналов, или, если необходимо, рефератов и баз данных. Список наиболее полезных источников по общим вопросам гистохимии приведен в табл. 5.20.

Таблица 5.20. Источники информации по методам

110

приготовления и окрашивания препаратов

Следует отметить еще несколько проблем.

1.Неспециалисту трудно бывает найти необходимую литературу. Имейте в виду, что помимо академических библиотек ее часто можно найти на лабораторных полках в гематологических, патогистологических и микробиологических отделениях больниц.

2.Качество указателей может очень сильно варьировать. Так, в книге, где лучше всего описана конкретная гистохимическая реакция, указатель может быть очень неполным.

3.Лексикон и система ключевых слов в большинстве баз данных и реферативных работ ориентированы на биологические объекты, а не на технические или методические термины.

В качестве примера рассмотрим ситуацию с ботаником, который хочет выявить богатые лигнином сосуды ксилемы в листьях древесных растений. Табл. 5.20 указывает на книгу «Методы окрашивания» под ред. Кларка [7], которая может содержать требуемую информацию. Оглавление книги подходит, поскольку оно содержит раздел под названием «Ботанические науки... анатомия растений». В указателе к данному разделу имеется 12 ссылок на «богатые лигнином сосуды», а кроме того — одна ссылка на «ксилему».

Ситуация, описанная в пункте 2 предыдущего раздела, представляет собой один из вариантов ситуации, изложенной в пункте 1 того же раздела. Здесь вам необходимо найти методы, отвечающие на вопросы, аналогичные поставленному вами. Например, если проблема состоит в том, чтобы выявить кислую фосфатазу в лизосомах у не изучавшегося ранее вида грибов, то в качестве отправной точки можно взять методы, которые успешно использовались для выявления данного фермента у других грибов.

4.2. Применение гистохимических маркеров для исследования новых свойств

Предположим, что поиск методики по описанной выше процедуре не дал результата. Допустим, что стоящий перед вами: биологический вопрос формулируется следующим образом: избирательно окрасить клетки простейшего, паразитирующего & печени больной овцы.

Предположим, что по данному виду простейших нет никакой гистохимической литературы, а в изданиях по паразитологии и ветеринарии отсутствуют ссылки на гистохимические работы.

В данном случае проблему следует переформулировать так,, чтобы она попала в область применения гистохимической методологии. Для этого надо решить, чем с химической, биологической или морфологической точки зрения простейшее может отличаться от окружающих его гепатоцитов. Например, содержит ли простейшее большие количества лизосом или митохондрий? Если да, то возможными гистохимическими маркерами являются лизосомные ферменты, такие, как эстеразы или кислая фосфатаза, или митохондриальные ферменты, такие, как сукцинатдегидрогеназа. Отличаются ли размер и форма ядра паразита от ядер гепатоцитов или эндотелиальных клеток? Или, может быть, они различаются по соотношению областей, занимаемых ядром и цитоплазмой? Если одно из двух последних предположений справедливо, то полезным диагностическим методом может оказаться окраска толстых срезов основным красителем.

Применение толстых срезов рассматривалось в разд. 2.2.3. Отметим, что метод приготовления препарата должен быть выбран с учетом вопроса, который вы пытаетесь решить, и природы самого объекта.

5. Оценка результатов гистохимического окрашивания

После того как гистохимическая реакция проведена, ее результаты необходимо оценить с точки зрения тех вопросов, которые были поставлены вначале. Поскольку гистохимические методы позволяют ответить на вопросы «что это такое?», «где оно находится?» и «сколько его?», то тест на достоверность должен включать проверку всех трех пунктов. Более того, следует рассмотреть значение как положительного, так и

111

отрицательного окрашивания.

Предположим, что после проведения какой-либо реакции вы обнаружили, что препарат окрашен. Прежде чем сделать заключение о том, что искомый объект в нем присутствует, необходимо ответить на следующие вопросы:

1)относится ли окраска именно к тому веществу (структуре), которое вас интересует в препарате? Этот вопрос относится к проблеме специфичности и/или избирательности окраски;

2)соответствует ли распределение красителя распределению искомого объекта в живой клетке или существе? Этот вопрос относится к проблеме локализации гистохимической реакции;

3)соответствует ли интенсивность окраски количеству присутствующего в препарате вещества? Это вопрос

отом, насколько метод количественный.

Теперь предположим, что в результате проведения реакции препарат не окрасился. Прежде чем сделать вывод об отсутствии искомого вещества или структуры, необходимо ответить на следующие вопросы:

1)отражает ли отсутствие окраски неуспех метода или же указывает на отсутствие искомого объекта? Этот вопрос относится к проблеме технического несовершенства и недостаточной чувствительности применяемого метода;

2)возможно ли, чтобы искомое вещество присутствовало в живой клетке (или организме) и было потеряно в процессе изготовления и/или окрашивания препарата. Это проблема стабилизации содержимого препарата;

3)не претерпел ли краситель изменений и не исчез ли он из препарата до начала наблюдений? Этот вопрос относится к проблеме выцветания и диффузии красителей.

В табл. 5.21 приводятся контрольные процедуры, которые необходимо выполнить для ответа на данные вопросы; обсуждение некоторых из указанных проблем дано ниже. Начинающим исследователям рекомендуется выполнять все требуемые контроли постоянно, а не прибегать к ним только в тех случаях, когда результаты окрашивания кажутся непонятными.

Таблица 5.21. Методы контроля результатов окрашивания

Во всех случаях проверьте чистоту реактивов.

5.1. Оценка селективности методов

Если окрашивается действительно искомое вещество или структура, тогда удаление их из препарата (экстракция) либо превращение в химически модифицированную форму (блокирование) должно приводить к исчезновению окраски.

Пример экстракции приведен в табл. 5.14, где описывается удаление суммарных липидов с помощью органических растворителей. Поскольку такая смесь растворителей не удаляет из препарата другой материал, то любое окрашивание Суданом черным, возникающее после экстракции, можно отнести к неспецифическому. Для избирательной экстракции определенных компонентов тканей используется также химический и ферментативный гидролиз. Избирательность данных методов зависит от химических процессов на стадии гидролиза, приводящих к расщеплению биополимеров на фрагменты, которые затем неспецифически экстрагируются растворителем.

I. Избирательная экстракция гликогена. Она производится с помощью быстрого ферментативного гидролиза гликогена амилазой; при этом другие биополимеры в клетках млекопитающих не повреждаются сколько-нибудь существенно. Подробности данного метода приведены в табл. 5.22.

112

Блокирование бывает различного характера. Например, если срез ткани интенсивно окрашивается кислыми красителями, то это может быть связано с присутствием в нем белка. Тогда обработка азотной кислотой, в результате которой катионогенные аминогруппы превращаются в неионные гидроксильные группы, должна предотвращать окраску. Аналогичным образом, ферменты могут быть инактивированы в результате нарушения их четвертичной структуры путем нагревания или обработки реакционноспособным альдегидом (см. табл. 5.12) либо ингибитором. Если после инактивации окрашивание сохраняется, то оно является артефактом и не связано с ферментом. Методы контроля не сводятся только к блокированию и экстракциям. Один из распространенных методов контроля состоит в том, чтобы избирательно пропускать .используемые в прописи реактивы, а затем сравнивать получающееся окрашивание с тем, которое получается при полной процедуре. Так, окрашиванию методом периодат—Шифф и реакции Фёльгена (табл. 5.9 и 5.11) мешает присутствие природных альдегидов. Однако их легко выявить, пропустив в стандартной методике соответственно стадии окисления и гидролиза, которые приводят к образованию альдегидных групп, и посмотрев, какие структуры после этого окрасятся.

Таблица 5.22. Экстракция гликогена диастазой

1.Возьмите два положительных контрольных препарата* и два тестовых среза. Если они получены из парафиновых блоков, то распарафинируйте их. Во всех случаях срезы необходимо размочить.

2.Проинкубируйте один тестовый срез и один положительный контрольный препарат в 1%-ном (вес на объем) водном растворе диастазы** в течение 1 часа*** при 37 °С.

3.Промойте препараты в течение 5—10 мин в проточной воде.

4.Окрасьте все срезы по методу для выявления гликогена, описанному в табл. 5.9 и 5.11 (периодатШифф).

Результаты. На наличие гликогена указывает отсутствие окраски после ферментативной обработки. Контроль. Положительные контрольные срезы показывают, что фермент активен и: методика окраски эффективна.

*Возьмите срезы богатой гликогеном печени.

**Сухая диастаза стабильна и стоит дешево. Делайте ее свежий раствор каждый день.

***Ткани, фиксированные жидкостью Гендра, водным раствором глутарового альдегида или четырехокиси осмия, устойчивы к ферментативному гидролизу. Поэтому время инкубации с диастазой надо увеличить.

5.2. Оценка локализации окрашивания

На каждой стадии изготовления и окраски препарата его компоненты могут перемещаться с тех мест, которые они занимали in vivo. Сдвиги наблюдаются при многих способах, окрашивания, причем иногда даже в процессе хранения окрашенных препаратов. Для уменьшения подобных артефактов используются различные технические приемы, например перфузия вместо погружения в фиксатор, что уменьшает поток растворителя сквозь кусочек ткани. Однако, на самом деле контроль за локализацией веществ проводить сложно. Единственный способ состоит в том, чтобы использовать несколько методов изготовления и окрашивания препарата и сравнивать результаты.

5.3. Оценка чувствительности и количественности окрашивания

Чтобы оценить на качественном уровне чувствительность реакции, окрасьте параллельно с исследуемым препаратом еще два известных препарата, которые содержат соответственно много и мало исследуемого вещества. Такой пример в отношении реакции на гликоген приведен в табл. 5.22.

Для оценки того, является ли метод количественным, можно использовать различные приемы. Можно определить количество вещества в различных препаратах до окрашивания, а затем установить, как коррелирует интенсивность окраски с содержанием вещества. Полученные данные можно затем применить к исследованию новых препаратов. В одном очень важном случае, а именно при количественном определении ДНК, таких измерений обычно не требуется, так как сравнение диплоидных и гаплоидных клеточных ядер дает вам свой внутренний стандарт. Можно использовать внешние стандарты, в качестве которых применяют разные модельные системы. Например, известное количество вещества можно поместить в полимерный матрикс, который затем залить в виде тонкого слоя или нарезать на срезы. Другой способ состоит в том, что вещество наносят на поверхность хроматографических носителей, частицы которых имеют микронные размеры. Такие образцы, содержащие известные количества вещества, затем окрашиваются одновременно с исследуемым биологическим образцом.

113