подходы.

1.2.1. Условия ограниченного числа фотонов

Видеоинтенсификация необходима в тех случаях, когда число фотонов недостаточное, особенно при работе

сфлуоресцентными и люминесцентными препаратами, исследуемыми в темном поле. Для VIM-метода требуются высокочувствительные камеры, которые, к сожалению, не являются камерами высокого разрешения. Однако с их помощью можно визуализировать ярко флуоресцирующие объекты, размеры которых находятся далеко за пределами разрешения светового микроскопа, в тех случаях, когда они достаточно удалены друг от друга (например, в случае разбавленной суспензии флуоресцирующих актиновых филаментов). Микроскопия при слабом освещении обычно требует использования всех методов видеомикроскопии, в том числе телекамер

свидеоусилением, аналогового усиления, разных способов цифровой обработки изображения, таких как вычитание фона (что необходимо из-за неравномерной чувствительности мишеней VIM-камер), усреднение (для уменьшения шума) и цифровое усиление (разд. 3). Сглаженные (из-за низких пространственных частот) изображения, получаемые VIM-методом, обычно пригодны для цифрового анализа интенсивностей и их изменений в изображениях (разд. 4.2).

1.2.2. Достижение высокой четкости и детализации изображения

Когда нужно достичь высокой четкости и детализации изображений, а размеры минимальных объектов не выходят за пределы разрешающей способности микроскопа (200 нм), следует применять телекамеры высокого разрешения. Они требуют достаточно большого количества света, однако могут быть использованы с системами дифференциального интерференционного контраста (DIG) или любыми другими, дающими большее количество света. В таком случае для усиления изображения потребуется VEC-микроскопия, но может оказаться, что достаточно умеренного аналогового усиления. Если изображение освещено неравномерно, то на данном уровне увеличения обычно достаточно его аналоговой коррекции (шейдинг-коррекция). Цифровой коррекции фона или цифрового усиления при этом обычно не требуется. Данный метод применяется обычно при наблюдениях за целыми клетками, в частности за изменением их формы, а также делением клеток или движением крупных органелл.

1.2.3. Визуализация объектов с минимальными размерами

Если ставится задача визуализировать наименьшие возможные объекты, мы также должны прибегнуть к VEC-микроскопии, используя для освещения технику дифференциального интерференционного контраста или косого освещения. С ее помощью можно различить микротрубочки (диаметр 25 нм) или пузырьки диаметром 50 нм [8, 91. Для этого понадобятся следующие функции электронных систем улучшения изображения: большое аналоговое усиление, высококачественная поляризационная световая микроскопия (DIG либо поляризационный микроскоп по Аллену [3, 4] или Иноэ [1]) и цифровая обработка изображения, включая вычитание фона в реальном времени и цифровое усиление. Если получающееся изображение содержит слишком много шумов, то необходимо провести усреднение в реальном времени по два или по четыре кадра или цифровую фильтрацию изображения (также в реальном времени).

Для большинства пользователей VEC- и VIM-методы являются взаимодополняющими, так как первый позволяет выявлять внутриклеточные детали, а последний дает возможность, применяя флуоресцирующие метки (красители или антитела), идентифицировать ранее увиденные объекты.

Для микроскопистов наиболее существенным требованием к оборудованию является быстрота его действия, т.е. процессор должен быть достаточно быстрым для того, чтобы давать изменения изображения в реальном времени. При этом для введения в компьютер команд должно использоваться всего несколько клавиш.

1.3. Различные методы видеомикроскопии

1.3.1. Видеомикроскопия с усилением

Видеомикроскопия с усилением значительно расширяет возможности светового микроскопа (рис. 8.1) и служит технической основой для развития ряда новых методик. VIM-метод сделал возможным наблюдение и запись таких изображений, которые слишком слабы для того, чтобы их можно было рассматривать или фиксировать непосредственно. Кроме того, он позволяет изучать живые клетки в течение длительных промежутков времени, не нарушая их нормальной метаболической активности и не обесцвечивая содержащихся в них фоточувствительных молекул.

Явления, связанные со слабым свечением, достаточно широко распространены в природе. Кроме того, в настоящее время необходимым инструментом для исследований в различных областях стали экзогенные люминесцирующие или флуоресцирующие молекулы, которые при использовании в качестве зондов позволяют выявлять различные клеточные структуры и функции. Применение VIM-метода в различных областях описано а литературе [7, 10, 11].

Микроскопия с видеоусилением особенно полезна в тех случаях, когда:

1) общее число фотонов, участвующих в формировании изображения, ограничено самой природой явления,

152

например при биолюминесценции или при флуоресценции, когда число меченных флуорохромом участков мало;

2)необходимо освещение низкой интенсивности, чтобы в ходе исследования избежать влияния света на биологический процесс (процессы) или исключить фототоксические эффекты;

3)происходят быстрые изменения, и количество света, которое можно получить за необходимый промежуток времени, мало;

4)длительная экспозиция, нужная для фотографирования на пленку, не дает возможности зафиксировать динамику процесса;

5)следует уменьшить возбуждение флуоресценции, чтобы подавить фотообесцвечивание;

6)количество метки должно быть ограничено, чтобы избежать влияния на биологические процессы. Методы аналогового усиления контраста (разд. 1.3.2) или цифровой обработки изображения часто бывают

очень полезны, хотя не всегда необходимы.

1.3.2. Аналоговое усиление контраста

Введение аналогового усиления стало большим достижением, благодаря которому световая микроскопия вышла на новый уровень. Цифровое усиление, как будет показано далее, часто служит полезным дополнением к аналоговому, но следует подчеркнуть, что оно не заменяет аналогового усиления.

Преобразования изображения, которые нужно произвести для аналогового усиления контраста, можно объяснить только на основе представлений о контрасте, рассеянном свете и разрешении. Поэтому ниже помещен краткий обзор каждого из данных аспектов световой микроскопии.

I. Рассеянный свет. Так называется свет, равномерно распределенный по изображению и не вносящий вклада в формирование его деталей. Некоторые из вызывающих его причин приведены в табл. 8.1. Во многих случаях рассеянный свет не дает возможности произвести оптимальную настройку микроскопа. Например, часто приходится жертвовать максимально возможным разрешением — закрывать для снижения яркости освещения диафрагму конденсора и снижать тем самым числовую апертуру. Когда используется поляризованный свет, то настройке часто мешает рассеянный неполяризованный свет, который появляется даже при наилучшей юстировке поляризаторов или призм. В телевизионном изображении рассеянный свет может быть удален с помощью электронных средств путем добавления к сигналу камеры постоянного отрицательного напряжения, которое называется напряжением смещения, или пороговым напряжением. Подачей на камеру подходящего напряжения смещения можно добиться усиления контраста, подбирая пороговое напряжение так, чтобы оно соответствовало уровню серого, нужному для получения наивысшего визуального контраста на экране монитора (рис. 8.2, Б и 8.3). На рис. 8.2 показано, чего можно достичь на каждом этапе обработки изображения данным способом. Очевидно, что детали препарата мышцы лучше всего видны на рис. 8.2, Е после применения цифрового усиления изображения.

Таблица 8.1. Различные источники рассеянного света

Светлопольная микроскопия

Избыточная аиертура конденсора Непросветленные поверхности линз

Свет, отраженный от внутренних поверхностей тубуса Микроскопия в поляризованном свете и интерференционная микроскопия. Вращение плоскости поляризации на поверхности линз Двулучепреломление из-за внутренней анизотропии линз Рассеяние света из-за пыли, на склейках линз и т. п.

Несовершенство поверхностей линз Дефекты (дырки) в поляризаторах Околомаксимальная компенсация

Флуоресцентная микроскопия

Аутофлуоресценция любого материала, находящегося на пути света Неспецифическая локализация флуорохромов

II. Контраст. С помощью телевизионной камеры яркость в каждой точке оптического изображения, создаваемого микроскопом, преобразуется в разность потенциалов. Контраст можно регулировать, увеличивая его в 100 раз и более путем подачи к сигналу камеры напряжения смещения, позволяющего наилучшим образом установить контраст. Глазом контраст (С) воспринимается приблизительно как разность между интенсивностью (яркостью) фона (Iф) и яркостью препарата (Iп), отнесенная, к яркости фона:

(1)

153

Рис. 8.2. Обработка малоконтрастного изображения. Препаратом служил ультратонкий (для электронной микроскопии) неокрашенный срез поперечнополосатой мышцы, который наблюдали с помощью дифференциального интерференционного контраста. Исходное изображение было получено без предварительной очистки оптики для того, чтобы продемонстрировать возможности метода применительно к изображению с необычно большим исходным загрязнением. А. Изображение в фокусе без усиления. Б. После аналогового усиления. В. Не в фокусе, с дефектами фона. Г. Не в фокусе, после вычитания фона. Д. В фокусе, после вычитания фона. Е. После цифрового усиления. Микроскоп

Zeiss, IM 405, Plan Neofluar X63/1.4, окуляр Х16,

проектив 63 мм (рис. 8.9,Л); процессор

Hamamatsu ARGUS 100; размер кадра — 42

мкм.

Перекрывающиеся изображения от двух близко расположенных объектов (точечных отверстий) и суммарное распределение интенсивности от них (обозначено штриховой линией) приведены на А. Согласно критерию Рэлея, два объекта разрешаются, когда центральный прогиб достаточно велик, чтобы быть заметным. Если изменить контраст за счет аналогового или цифрового переопределения нижнего уровня (уровня черного) до указанного тонкой линией и соответственно усилить сигнал, то можно получить намного более четкое изображение Б. В. Те же объекты, но находящиеся на более близком расстоянии, так что они не могут быть разрешены согласно критерию Рэлея. Однако, если увеличить контраст (Б), то даже и в этом случае можно получить изображение, где объекты будут видны раздельно (Г). Предел разрешения Спарроу достигается тогда, когда между двумя пиками нет впадины.

Рис. 8.3. Дифракционная картина (распределение Эри) от очень маленького объекта характеризуется центральным максимумом нулевого порядка и меньшими максимумами 1-го, 2-го и высших порядков.

III. Изменение контраста. Регулирование контраста с помощью прямого и обратного напряжения смешения может применяться к изображениям, получаемым любым методом сметной микроскопии. В случае использования поляризованного света значительный дополнительный контраст можно получить путем установки компенсатора на большее смещение запаздывания (AVEC-микроскопия, разд. 2.3). Получающиеся изображения часто имеют недостаточный видимый контраст, так как изма рассеянного света знаменатель в уравнении (1) слишком велик (разд. 2.1 и рис. 8.10). Однако в электронном изображении напряжение смещения, приложенное к видеосигналу, играет роль, аналогичную «отрицательной яркости или интенсивности» (IB), которая вычитается из знаменателя. Тогда видеоконтраст (СB), описывается уравнением:

(2)

После того как рассеянный свет был скомпенсирован обратным напряжением, аналоговый сигнал камеры может быть вновь установлен так, чтобы использовать для получения необработанного изображения всю шкалу серого.

154

IV. Усиление контраста и разрешение деталей. Разрешение может быть увеличено за счет усиления контраста, поскольку согласно критерию Рэлея разрешение обусловлено таким снижением освещенности между двумя пиками, при котором максимумы различимы глазом, т.е. на 15%. Когда вместо глаза используется телекамера, то критерий Рэлея заменяется критерием Спарроу [12] (рис. 8.3, В и Г). Последний приложим к электронным изображениям, поскольку они могут быть усилены настолько, что даже незначительный прогиб в распределении интенсивности в случае двух необработанных изображений (рис. 8.3, В) превращается в четкое разделение пиков (рис. 8.3,Г). Это увеличивает разрешение примерно в два раза. При использовании лучших линз, когда аберрации незначительны, качество изображения лимитируется только размером дифракционного пятна, в которое превращается каждая его точка.

V. Усиление контраста и визуализация объектов. Объекты, размеры которых находятся за пределами разрешения, дают дифракционные пятна (диски Эри) малой амплитуды (интенсивности). Величина этих дисков не может быть уменьшена. Однако благодаря видеоусилению такие невидимые слабые диски Эри можно визуализировать, хотя, если расстояние между двумя объектами меньше предела разрешения, дифракционные картины этих объектов по-прежнему будут сливаться. Следовательно, используя усиление контраста, мелкие объекты можно визуализировать, но нельзя разрешить. Используя дифференциальный интерференционный контраст по Номарскому или VEC-микроскопию, можно увидеть биологические структуры с размерами от 15 до 20 им, а другие материалы, такие как коллоидное золото, становятся видимыми при диаметре частиц 5 им и менее. Дифракционные картины от многочисленных очень мелких объектов, расстояние между которыми меньше разрешающей способности микроскопа, компенсируют друг друга, так что в изображении ничего не видно. Такая ситуация имеет место в случаях очень мелких клеток или переполненных органеллами нервных окончаний.

VI. Преимущества аналогового усиления контраста.

1.Рассеянный свет удаляется в видеоканале подачей напряжения смешения (IB).

2.Практически достижимое разрешение увеличивается примерно вдвое. Это происходит благодаря замене критерия Рэлея на критерий Спарроу, и отчасти потому, что можно использовать в работе более высокие числовые апертуры, так как избыточная яркость изображения, возникающая из-за рассеянного света, может быть устранена с помощью напряжения смешения.

3.Выигрыш в контрасте достаточен для того, чтобы в живых клетках cia.ni мидии структуры, по размерам примерно па порядок меньшие, чем те, которые могли быть разрешены

или обнаружены в тех же условиях до усиления контраста (рис. 8.1).

4.В условиях AVEC-микроскопии снижаются дифракционные аномалии, которые при использовании методов, основанных на использовании поляризованного света, дают ложные детали и контраст. Эти аномалии возникают в результате деполяризации света на поверхностях линз или из-за остаточного двулучепреломления

вобъективе (разд. 2.1).

VII. Ограничения метода аналогового усиления контраста.

1.Параллельно с усилением видеосигнала усиливается и электронный шум, так что могут понадобиться системы для его подавления (разд. 2.3 и 3.2).

2.Если оптическая система (включая предметное и покровное стекла) содержит пыль, грязь или дефекты, возникшие при изготовлении препарата, то они будут создавать фиксированную картину пятен (крап), усиливаемых вместе с изображением. От них можно избавиться только путем цифровой обработки (разд. 2.3).

3.Если осветительная система примитивна или неправильно настроена и сфокусирована (для освещения по Кёлеру), то поле зрения может быть освещено неравномерно. Для получения хороших результатов при VECмикроскопии требования к равномерности освещения значительно выше, чем при обычной фотомикрографии.

Визвестной степени неравномерность освещения, как и фиксированная картина пятен, может быть устранена с помощью цифрового вычитания (рис. 8.4) (разд. 2.3).

1.3.3.Цифровая обработка изображения

Многие методы стандартной цифровой обработки изображения были известны задолго до того, как их ценность стала понятна микроскопистам [5, 13]. В связи с бурным развитием быстродействующих компьютеров появилась возможность выполнять многие виды обработки изображения при скоростях видеозаписи. Принципы цифровой обработки изображения и некоторые конкретные виды ее были описаны в гл. 7. В VIM-.и VECмикроскопии они используются для быстрой предварительной обработки с целью улучшить качества изображения до того, как оно будет записано на магнитную ленту или диск. Следует подчеркнуть, однако, что отдельные кадры, уже записанные, можно подвергнуть дальнейшей цифровой обработке с использованием соответствующей техники и видеопроцессоров, рассмотренных в гл. 7. Большинство описанных в гл. 7 процессоров принципиально отличаются от тех, о которых речь пойдет ниже, так как последние дают возможность производить операции над изображением со скоростью видеозаписи, позволяя обрабатывать видеоизображения живых объектов.

155

Рис. 8.4. Коррекция неравномерности освещения путем вычитания фона в усиленном аналоговым способом изображении. Если после фиксации потенциальных дефектов в оптике (этап 11 разд. 2.3) и максимально возможной коррекции неравномерности освещения аналоговым способом (разд. 1.4.1) получается такое изображение, как в А, то оно даст при дальнейшем аналоговом усилении очень мешающее яркое пятно (Б). Вычитание пятнистого фона без изображения объекта (В) дает неравномерно освещенное изображение (Г). Данная последовательность фотографий демонстрирует также пользу применения масштабной линейки и указателя времени (от месяцев до сотых долей секунды) и, кроме того, возможность измерения интенсивности вдоль выбранной линии (разд. 4.2). В качестве препарата использовалась диатомовая водоросль Amphipteura pellucida с периодом исчерченности 250 нм. Микроскоп Axiophot Zeiss, объектив Планахромат Х100/1,25,

процессор Hamamatsu С 1966, Photonic Microscope System.

После аналогового усиления контраста аналоговый телевизионный сигнал (график изменений потенциала) оцифровывается так, что он становится доступным для обработки арифметической логической ячейкой видеопроцессора. В большинстве пригодных для этого видеопроцессоров способы осуществление некоторых арифметических преобразований заложены в постоянное запоминающее устройство (ПЗУ) или осуществляются с помощью пакетов макросов (макрокоманд) в программном обеспечении, так что оператор может легко научиться обработке изображения с использованием наиболее удобных операций. Ввод команд занимает несколько секунд, а операции обработки выполняются в «реальном времени», то есть укладываются в интервал между двумя последовательными телекадрами (25 или 30 раз в секунду в зависимости от используемого телевизионного стандарта).

В ходе оцифровки изображение разделяется на 512 или более линий по 512 или более точек (пикселов) в каждой. Обычно каждый пиксел содержит 256 уровней серого (8 бит), где 0 определяется как черный цвет, а 255 — как яркий белый (разд. 4 гл. 7). В зависимости от сложности проводимых операций требуется объем памяти на 1—3 кадра (512x512 пикселов). Если проводится усреднение или какая-либо другая процедура, требующая большого числа кадров, объем памяти должен составлять более 8 бит в глубину (желательно —

16 бит).

I.Последовательное усреднение и прыгающее усреднение. Последовательное усреднение заключается в вычислении среднего между последним приходящим в компьютер изображением и хранящимся в компьютере ранее полученным изображением. Данный метод представляет собой нормированное усреднение е доминированием более поздних кадров (обратная фильтрация). При прыгающем усреднении усредняется заранее выбранное число кадров, и картина выводится на экран, а в это время происходит накопление следующей порции кадров, вывод которых задерживается. При обеих операциях электронный шум видеосигнала уменьшается пропорционально квадрату числа усредненных кадров. Первая операция смазывает

иделает менее четким любое движение, тогда как последняя, наоборот, подчеркивает даже медленное движение. Обе они обычно используются в VIM-методе; их применение целесообразно также и в VECмикроскопии при использовании большого усиления, когда начинает мешать электронный шум.

II.Вычитание неравномерного (пятнистого) фона. Дефекты в виде пятен в изображении (крап)

сохраняются, если препарат расфокусировать или вывести из поля зрения (рис. 8.2, Б). Соответственно крап можно сохранить («заморозить») в видеопамяти и затем вычитать из каждого кадра входящего видеосигнала (рис. 8.2,Г). Данная операция (вычитание фона) приводит к очистке изображения (рис. 8.2, Д). Та же процедура устраняет неравномерность яркости фона (рис. 8.4) в случаях, когда ее перепады не превосходят «окна» в 256 разрешенных уровней серого.

III.Цифровое усиление. После аналогового усиления и очистки фона изображение может быть недостаточно контрастным. В этом случае его можно усилить цифровым способом, например растянув гистограмму уровней серого (рис. 8.2, Е). Данная процедура подобна аналоговому усилению, но выбор уровней серого производится по их числовому значению. Оператор выбирает определенный отрезок спектра уровней серого, содержащий информацию об изображении, и растягивает его в длину на всю дистанцию, содержащую 256 уровней серого, от черного до белого. Это делается переопределением новых уровней серого и их добавлением вместо старых

156

(процедура обозначена в меню). Необходимо помнить, что цифровое усиление не может заменить аналогового усиления (разд. 1.3.2).

IV. Выявление движения путем последовательного вычитания или вычитания через интервалы времени.

Усиленное аналоговым способом изображение можно подвергнуть последовательному вычитанию с целью выявить и наблюдать в нем только движущиеся элементы. Для этого опорное изображение «замораживается» в памяти, после чего, не сдвигая и не расфокусируя образец, из «замороженного» изображения вычитают все последующие изображения. Вычитание хранящегося в памяти изображения из очень близкого к нему последующего изображения (живого объекта) приводит к появлению пустого изображения, не содержащего ничего, кроме движущихся элементов, которые вызывают различия в изображениях и таким образом обнаруживают себя (рис. 8.5). Это исключительно чувствительный метод определения движения, который, однако, дает удовлетворительные результаты только при использовании очень стабильного микроскопа и при хорошем контроле температуры. Любой дрейф фокуса или нагрузка, приложенная к столику или станине микроскопа, могут вызвать появление искаженного изображения всего объекта. Данный метод дает положения движущегося объекта в момент времени «О» (замороженное, где объект виден в негативном контрасте, иначе говоря, изображение «отсутствующего объекта») и реальное положение объекта в настоящий момент времени (рис. 8.5). С помощью этого метода очень удобно проводить измерения скорости. Вычитание через определенные интервалы является вариантом последовательного вычитания, когда запрограммировано «размораживание» хранящегося в памяти изображения, из которого производится вычитание, и автоматическая замена его на новое через определенное число кадров с последующим вычитанием нового «фонового» изображения из приходящих видеосигналов.

V. Получение псевдоцветного изображения. Данный процесс позволяет пользователю систематически или по своему выбору присваивать цвета различным уровням серого. Этот прием может быть очень полезен для того, чтобы различать сложные распределения оттенков серого или незначительные вариации интенсивности.

Для VIM-метода могут быть особенно полезны следующие дополнительные функции.

Рис. 8.5. Избирательное выявление движущихся объектов с помощью последовательного вычитания. А. Когда вычитание одного изображения (29 : 40 с): из другого (29: 50 с) произведено через 0,1 с, т. е. через 5 кадров, в их разности практически отсутствует контраст, поскольку все предметы остались вблизи от своего начального положения. Через 2 с (Б) (31 : 50 с) движущиеся органеллы становятся видимыми. Каждая органелла видна в кадре дважды: один раз как выступающая структура и один раз как выемка. Положение выемки соответствует начальному расположению органеллы, т. е. месту, где ее в настоящее время нет, а сама движущаяся структура на экране монитора имеет положительный контраст. Наблюдалось движение митохондрий (удлиненные структуры) и лизосомоподобных органелл (округлые структуры) в пучке аксонов (диаметром 0,25 мкм) слухового нерва щуки. Большинство органелл, за исключением одной митохондрии в центре, движутся вправо вниз.

Микроскоп Polyvar Reichert/Cambridge Instruments, План ахромат х100/1,32, процессор Hamamatsu С 1966, Photonic Microscope System, масштабная линейка 2,7 мкм.

VI. Очистка кадра (или луча). Это еще один метод для улучшения отношения сигнал/шум при приеме изображения. Здесь заряд на поверхности камеры накапливается в течение более продолжительного промежутка времени, а не снимается каждую 1/25 или 1/30 с (нормальная скорость телевизионной развертки). За счет этого значительно снижается количество считываемого шума. Так, например, при обычной интеграции 64-х кадров суммируется 64 изображения, каждое из которых содержит определенный процент считываемого шума. Однако если позволить изображению накапливаться до считывания на мишени камеры в течение времени, соответствующего 16-ти кадрам, то шум 64 кадров окажется уменьшенным в 16 раз.

VII. Пространственная фильтрация. Если к изображению применять различные операции свертки, то оно может быть «отфильтровано» в пространственном отношении. Этот метод позволяет подавить шум или выделить часто встречающуюся информацию, например обозначить границы или получить более резкое изображение (подробнее — в гл. 7).

VIII. Арифметические операции. Данная функция позволяет применять основные арифметические операции

157