Литература

1. Биохимия мозга. Под ред. И.П. Ашмарина, П.В. Стукалова, Н.Д. Ещенко. СПб, 1999, 328 с.

2. Дубынин В.А., Ивлева Ю.А., Стоволосов И.С. и др. // Доклады Академии наук, 2007, т. 412 (2), с. 279-282.

3. Дубынин В.А., Ивлева Ю.А., Каменский А.А. // Успехи физиологических наук, 2004, т. 35 (1), с. 83-101.

4. Panksepp J., Nelson E., Siviy S. // Acta Paediatr., 1994, v. 397 (1), p. 40-46.

5. Agmo A., Barreau S., Lemaire V. // Dev. Neurosci., 1997, v. 19 (6), p. 505-520.

6. Добрякова Ю.В., Беляева Ю.А., Стоволосов И.С. и др. // Бюлл. эксперим. биологии и медицины, 2006, т. 142 (8), с. 124-127.

7. Rosenblatt J.S., Mayer A.D., Giordano A.L. // Psychoneuroendocrinology, 1988, v. 13 (1-2), p. 29-46.

8. Kinsley C.H., Bridges R.S. // Pharmacol. Biochem. Behav., 1986, v. 25 (5), p. 1007-1011.

9. Косенкова Н.С., Пошивалов В.П. // Бюлл. эксперим. биологии и медицины, 1989, т. 107 (2), с. 207-209.

10. Haney M., Miczek K.A. // Psychopharmacol. (Berl.), 1989, v. 98 (1), p. 68-74.

11. Lindstrom L.H., Nyberg F., Terenius L. et al. // Am. J. Psychiatry, 1984, v. 141 (9), p. 1059-1066.

12. Koch G., Wiedemann K., Drebes E. et al. // Regul. Peptides, 1988, v. 20 (2), p. 107-117.

13. Nyberg F., Lieberman H., Lindstrom L.H. et al. // J. Clin. Endocrinol. Metab., 1989, v. 68 (2), p. 283-289.

14. Renlund S., Erlandsson I., Hellman U. et al. // Peptides, 1993, v. 14 (6), p. 1125-1132.

15. Каменский А.А., Дубынин В.А., Беляева Ю.А. // Природа, 2006, № 5, с. 23-29.

Влияние неонатального введения аргинин-вазопрессина и его аналога n-ac-d-met-pro-arg-gly-nh2 на поведение крыс-«подростков»

П.А. Ким, О.Г. Воскресенская, А.А. Каменский, В.П. Голубович

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

Институт биоорганической химии НАН Беларуси

На сегодняшний день одним из наиболее интенсивно изучаемых классов биологически активных веществ являются регуляторные пептиды. Интерес к эндогенным пептидным регуляторам вызван тем, что они способны прямо или опосредованно воздействовать на физиологические процессы, а любое нарушение в деятельности пептидной регуляторной системы может привести к развитию целого ряда патологических реакций организма. Кроме того, в настоящее время ведутся исследования, направленные на создание широкого спектра новых лекарственных средств на основе пептидов.

Система регуляторных пептидов, наряду с прочими процессами, принимает активное участие в механизмах памяти и регуляции уровня тревожности и ориентировочно-исследовательского поведения. Одним из таких пептидов является гормон задней доли гипофиза аргинин-вазопрессин (АВП). АВП обладает ярко выраженным положительным влиянием на выработку условных реакций и функции, связанные с памятью [1].

Установлено, что некоторые фрагменты и искусственно синтезированные аналоги природных пептидов зачастую обладают более выраженным действием, чем эндогенные соединения. Значительное увеличение эффективности наблюдается при замене некоторых аминокислотных остатков их D-изомерами, что делает пептидную молекулу более устойчивой к деградации и способствует достижению пептидом клеток-мишеней в больших концентрациях, увеличивая его нейротропную активность. Исходя из этого, на основании конформационного анализа был синтезирован тетрапептид Ac-D-Met⁶-Pro⁷-Arg⁸-Gly⁹-NH₂ (Ac-D-MPRG).

Характер и направленность нейротропного действия Ac-D-MPRG сходны с таковыми у АВП. При этом исследованный пептид значительно более эффективен в отношении обучения животных, чем целый гормон [2]. Высокая активность Ac-D-MPRG при интраназальном способе введения позволяет рассматривать этот препарат как перспективный с точки зрения возможного клинического применения.

Целью представленной работы явилось исследование влияния неонатального хронического введения АВП и Ac-D-MPRG на уровень ориентировочно-исследовательской реакции и тревожности, а также на обучение с положительным и отрицательным подкреплением у крыс-«подростков» (в возрасте 35-46 дней).

Работа выполнена на нелинейных белых крысах, которых содержали в стандартных условиях вивария со свободным доступом к воде и пище. Всего в работе было использовано 277 крыс.

Опыты проводились на детенышах крыс обоего пола. Крысята каждого выводка содержались в отдельной клетке вместе с матерью до достижения ими месячного возраста. На 45-й день жизни самцов отсаживали от самок для того, чтобы в дальнейшем избежать спаривания животных, так как они достигали половозрелого возраста.

В опытах использовали аргинин-вазопрессин (АВП) (фирма «Сигма») и структурный аналог С-концевого фрагмента аргинин-вазопрессина – тетрапептид N-Ac-D-Met-Pro-Arg-Gly-NH₂, синтезированный в Институте Биоорганической Химии НАН Беларуси.

Каждый выводок делили на 2 группы: опытную и контрольную. Животным опытной группы препараты вводили интраназально (и/н) с 8-го по 14-й дни жизни в объеме 1 мкл/10 г массы тела в следующих дозах: АВП – 10 мкг/кг (9 нмоль/кг; самая малая из используемых при и/н введении доз), Ac-D-MPRG  10,0 мкг/кг и 0,01 мкг/кг (20 нмоль/кг и 20пмоль/кг; максимальная и минимальная эффективная дозы по данным однократного введения пептида соответственно). Контрольным животным вводили эквивалентный объем растворителя (дистиллированной воды).

В препубертатный период (с 35-го по 46-й дни жизни) проводили тестирование ориентировочно-исследовательского поведения (в тестах «открытое поле» и «норковая камера») и уровня тревожности (в тесте «приподнятый крестообразный лабиринт»), а также, в разных сериях эксперимента, обучение с положительным и отрицательным подкреплением. В первом случае пищедобывательный навык вырабатывался в сложном лабиринте; во втором ­– формировался условный рефлекс активного избегания (УРАИ).

Результаты, полученные в тесте «приподнятый крестообразный лабиринт», свидетельствуют о том, что у животных, получавших в неонатальный период развития АВП, наблюдается снижение уровня тревожности, проявляющееся в увеличении латентного периода захода в темный отсек и снижения количества переходов из одного темного отсека в другой. Введение Ac-D-MPRG в обеих использованных дозах выраженного влияния на уровень тревожности крыс-«подростков» не оказывает.

Исследование влияния пептидов на уровень ориентировочно-исследовательской реакции показал, что введение АВП его практически не оказывает, в то время как применение аналога гормона обладает модулирующим действием в отношении данного параметра. Так, при введении Ac-D-MPRG в дозе 10 мкг/кг у крыс-«подростков» наблюдается снижение уровня ориентировочно-исследовательской реакции, а при введении в дозе 0,01 мкг/кг – его возрастание. Это проявляется в уменьшении и увеличении, соответственно, количества стоек. Стоит также отметить, что при использовании АВП и его аналога в большой дозе у крыс наблюдается снижение уровня груминга, что свидетельствует о понижении у них уровня эмоциональной напряженности, связанной с конфликтом ориентировочно-исследовательской и пассивно-оборонительной мотиваций.

Рассмотрим далее эффекты АВП и Ac-D-MPRG на обучение животных в препубертатный период развития. При обучении с отрицательным подкреплением у животных, получавших в неонатальный период АВП, наблюдается увеличение количества коротколатентных избавлений на 3-й день обучения. Это говорит о том, что у них к этому времени еще не происходит четкого разделения безусловного и условного раздражителей, а это, в свою очередь, приводит к снижению количества выполненных реакций. Стоит также отметить, что при проверке сохранения выработанного навыка у животных, получавших пептид, наблюдается тенденция к увеличению количества выполненных реакций. Это говорит о том, что у животных опытной группы сформированный навык сохраняется лучше, чем в контроле. С момента завершения обучения до дня проверки его сохранения у крыс, получавших АВП, происходит «доучивание»: количество выполненных реакций на 11-й день обучения у них выше, чем на 4-й. В контроле эти параметры практически не отличаются. Таким образом, введение АВП на ранних сроках обучения приводит к улучшению обучения с отрицательным подкреплением.

У животных, получавших в неонатальный период развития Ac-D-MPRG в дозе 10 мкг/кг, выработка УРАИ в первые дни происходит быстрее, чем в контроле. В первый день обучения у них наблюдается увеличение количества выполненных реакций, а на второй – коротколатентных избавлений. Данные различия говорят о том, что животные уже знают, где расположена полка, однако условный раздражитель – звонок – не является достаточным условием для выполнения реакции. Стоит также отметить, что в опытной группе наблюдалась тенденция к уменьшению количества межсигнальных реакций на 3-й день обучения. Это свидетельствует о том, что к данному времени дифференцировка условного раздражителя происходит лучше у крыс, получавших Ac-D-MPRG. При проверке сохранения выработанного навыка значимых отличий между опытной и контрольной группами не наблюдалось. Таким образом, можно сказать, что неонатальное введение аналога АВП в дозе 10 мкг/кг приводит к улучшению обучения с отрицательным подкреплением у крыс-«подростков», однако не способствует сохранению выработанного навыка.

Ac-D-MPRG в дозе 0,01 мкг/кг при выработке УРАИ оказался неэффективным.

При оценке влияния пептидов на обучение с положительным подкреплением были получены следующие результаты. При проверке выработки навыка у животных, получавших АВП, было выявлено увеличение количества выполненных реакций и снижение латентного периода выхода из первого отсека лабиринта. Это свидетельствует о том, что неонатальное введение АВП приводит к улучшению выработки условной пищедобывательной реакции на место, т.е. обучения с положительным подкреплением.

У крыс, получавших Ac-D-MPRG, наблюдается увеличение длительности латентного периода выхода из первого отсека лабиринта: на первый день обучения и при проверке выработки навыка. Также через неделю после последнего сеанса обучения у них отмечается уменьшение количества выполненных реакций. Все эти данные свидетельствуют о том, что неонатальное введение Ac-D-MPRG в данной дозе приводит к ухудшению обучения с положительным подкреплением в препубертатный период.

Стоит отметить, что наблюдавшееся на первый и третий день выработки навыка уменьшение количества ошибок у животных опытной группы говорит не об улучшении обучения, а, скорее, о снижении уровня ориентировочно-исследовательской реакции. Кроме того, снижение уровня груминга, выявленное на второй день формирования условной реакции, свидетельствует о пониженной эмоциональной реактивности животных. Эти результаты подтверждаются в тестах «открытое поле» и «норковая камера». Ac-D-MPRG в дозе 0,01 мкг/кг, как и в случае с обучением с отрицательным подкреплением, не оказывает выраженных эффектов при выработке условной пищедобывательной реакции на место.

Подводя итоги исследования, можно заключить, что АВП оказывает выраженное ноотропное и анксиолитическое действие у крыс-«подростков», а также приводит к снижению уровня их эмоциональной реактивности, не влияя на параметры ориентировочно-исследовательского поведения. Введение Ac-D-MPRG в дозе 10 мкг/кг приводит к снижению уровня эмоциональной напряженности животных и их ориентировочно-исследовательской активности и улучшает обучение с отрицательным подкреплением. Применение малой дозы Ac-D-MPRG (0,01 мкг/кг) влияния на уровень тревожности, эмоциональной реактивности и способность к обучению не оказывает, приводя лишь к усилению ориентировочно-исследовательского поведения.

Механизмы, лежащие в основе описанных изменений поведения животных под воздействием пептидов до конца не ясны, и их изучение требует проведения дальнейших исследований. Различия в паттерне нейротропной активности использованных препаратов могут быть обусловлены их воздействием на различные рецепторы и внутриклеточные эффекторы, а также влиянием на факторы роста нервной ткани. Так, применение разных (сильно отличающихся друг от друга) доз одного и того же вещества может, в одном случае, приводить к активации, а в другом – к десенситизации, интернализации и down-регуляции рецепторов.