Анализ гомологичных белков

Гомологичные белки — белки, которые выполняют одну и ту же функцию, но различаются по первичной структуре (например, локализованы в различных органах или образуются при патологических состояниях). Например, HbA (содержит Glu)  HbS (содержит Val) при серповидноклеточной анемии.

Метод пептидных карт (отпечатков пальцев), предложенный Ингремом

Этапы:

1. оба анализируемых белка расщепляют на фрагменты (пептиды);

2. смесь пептидов каждого белка наносят в виде пятна на угол листа хроматографической бумаги;

3. проводят электрофорез в горизонтальном направлении;

4. проводят распределительную хроматографию в вертикальном направлении;

5. полученные карты окрашивают и сравнивают;

6. различающиеся пептидные пятна выделяют и анализируют их аминокислотный состав.

Таким образом, использование пептидных карт позволяет анализировать не всю молекулу белка, а только те фрагменты, которые различаются между собой.

Установление ак-последовательности белка

I. Определение n-концевой ак

1. Метод Сэнджера. Белок обрабатывают динитрофторбензолом (ДНФБ). При этом с данным реагентом взаимодействует только N-концевая АК. Далее проводят полный гидролиз белка до аминокислот. Концевая АК, связанная с ДНФБ, после реакции окрашена в желтый цвет. Далее проводят идентификацию методом тонкослойной хроматографии в присутствии эталонов — ДНФБ-производных аминокислот, и устанавливают АК, которая связалась с ДНФБ в исходном белке.

2. Взаимодействие N-концевой АК с дансилхлоридом с образованием флуоресцирующего соединения. Дальнейший гидролиз и контроль методом тонкослойной хроматографии в присутствии эталонов позволяют выявить N-концевую АК.

3. Метод Эдмана. В данном методе используется фенилизотиоцианат (ФИТЦ), который также связывается с N-концевой АК с образованием соединения оранжевого цвета. При этом полный гидролиз белка проводить не нужно, в специально подобранных условиях происходит отщепление только N-концевой АК, которую далее идентифицируют.

4. Ферментативный метод с использованием аминопептидаз — специальных ферментов, которые избирательно отщепляют N-концевые АК, например, аланиновая аминопептидаза.

II. Определение с-концевой ак

1. Метод Акабори. В данном методе белок обрабатывают гидразином. Гидразин разрушает пептидные связи и реагирует со всеми аминокислотами, за исключением С-концевой АК, т.к. ее карбоксильная группа не участвует в образовании пептидной связи. При этом образуется смесь соответствующих гидразинов и свободной С-концевой АК. Последнюю после обработки всей смеси ДНФБ, как в методе Сэнджера, отделяют и идентифицируют методом тонкослойной хроматографии в присутствии эталонов.

2. Ферментативный метод с использованием карбоксипептидаз. Карбоксипептидаза А отщепляет ароматические С-концевые АК, карбоксипептидаза В — основные С-концевые АК.

III. Определение ак-последовательности

Общий подход к определению АК-последовательности включает следующие стадии:

1) проведение частичного гидролиза белка ферментами или химическими реагентами: для определения полной АК-последовательности белка должны быть использованы по крайней мере два различных типа частичного гидролиза с тем, чтобы установить структуру белка методом перекрывающихся пептидов;

2) выделение полученных пептидов;

3) определение АК-последовательностей этих небольших фрагментов. Для этого используется автоматический анализатор (секвенатор), в котором определение последовательности аминокислот происходит на основе метода Эдмана. Прибор позволяет за короткое время получить информацию об аминокислотном составе исследуемого пептида.