Блот-анализ днк (Саузерн-блот)

В геноме человека уже открыты гены и установлены последовательности, отвечающие за развитие муковисцидоза, гемофилии, серповидноклеточной анемии, болезни Альцгеймера, семейной гиперхолестеролемии, болезни Гоше и др. Саузерн-блот позволяет диагностировать такие наследственные заболевания путем обнаружения в геноме «дефектных» генов, отвечающих за их развитие. В основе метода лежит технология гибридизации (образование гибридов зонд – мишень). Зондом служит одноцепочечная молекула ДНК, меченная радиоактивным Р³² и комплементарная искомому гену

Этапы проведения Саузерн-блота:

• выделение ДНК из биологического материала;

• разрезание ДНК на более мелкие фрагменты с помощью рестриктаз;

• разделение фрагментов в агарозном геле;

• перенос на нитроцеллюлозу;

• блокирование «пустых» зон избытком ДНК;

• обработка зондом и образование гибридов;

• отмывка несвязавшегося зонда, ауторадиография и расшифровка результатов. Если проявляется полоска, значит, произошло связывание специфического зонда с ДНК пациента.

Такая диагностика наследственной патологии может проводиться и пренатально, в качестве биологического материала в этом случае используют клетки амниотической жидкости.

Принцип гибридизации с радиоактивным зондом лежит и в основе широко используемого метода "отпечатков пальцев ДНК". Каждый организм имеет свою неповторимую последовательность нуклеотидов в ДНК с уникальным расположением сайтов для действия рестриктаз. Поэтому после выделения ДНК и разрезания ее рестриктазами образуются фрагменты разной величины. Эти фрагменты разделяют методом электрофореза в агарозном геле и проводят гибридизацию с пробами радиоактивной ДНК (обычно используют несколько зондов). Каждый зонд специфически присоединяется только в одном или двух местах. Такая разновидность метода получила название «анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов» (RFLP, restriction fragment length polymorphism). Конечная картина состоит из ряда полосок, их расположение уникально и характерно только для одного человека. Одинаковые «отпечатки пальцев ДНК» могут иметь только однояйцевые близнецы.

Применение метода «отпечатков пальцев ДНК»:

1. Для идентификации личности.

2. В судебно-медицинской практике — неопровержимое доказательство принадлежности пятен крови, спермы, др. биологического материала.

3. Комплексная диагностика ряда наследственных заболеваний, в том числе в генетических консультациях для оценки вероятности рождения больного ребенка.

4. Поиск участков в ДНК, ответственных за развитие патологии (одновременное обследование больного и его родственников позволяет обнаружить изменения в ДНК, ведущие к развитию болезни.

5. Установление отцовства. В приведенном на рисунке примере — «отпечатки пальцев ДНК» матери (М), ребенка (Р), и двух предполагаемых отцов (О₁ и О₂). Легко установить, что только один из них (О₂) может быть биологическим отцом данного ребенка.

Если ДНК присутствует в биологическом материале в минимальных количествах, используется способ искусственного умножения ДНК — полимеразная цепная реакция (ПЦР). Для проведения ПЦР в пробирке смешиваются компоненты, необходимые для размножения ДНК: исследуемый материал (образец ДНК, который послужит матрицей), субстраты для синтеза (дезоксинуклеозидтрифосфаты), праймеры, ДНК-полимераза (Taq-полимераза). Каждый цикл удвоения ДНК включает в себя несколько этапов (рис 19.2).

1. Нагревание до 90 ºС (денатурация ДНК).

2. Охлаждение до 55 ºС (присоединение или «отжиг» праймеров).

3. Нагревание примерно до 72 ºС (удвоение ДНК).

Затем цикл повторяется. В течение 3 часов можно получить 1 миллион копий ДНК для последующего анализа.

Метод используется в судебной медицине, позволяет выявлять носительство мутантных генов, широко применяется для диагностики инфекционных заболеваний (туберкулез, хламидиоз, цитомегаловирусная инфекция, СПИД и др.). ПЦР позволяет обнаружить возбудителя в биологическом материале даже тогда, когда другие методы оказываются неэффективны.

ДНК-чипы (биочипы, DNA microarray technology)

Данная технология позволяет проводить анализ большого числа генов одновременно. ДНК-чип представляет собой пластинку, на которой зафиксированы небольшие одноцепочечные фрагменты ДНК. Эти фрагменты — комплементарные копии генов, анализ которых представляет интерес для исследователя. Метод основывается на проведении реакции гибридизации флюоресцентно-меченых исследуемых образцов ДНК с чипом. В дальнейшем проводится считывание информации и компьютерный анализ результатов.

Клонирование — способ получения большой популяции идентичных молекул, клеток, организмов — потомков одного предка.

Для клонирования отдельных генов используются технологии рекомбинантных ДНК: нужный ген на специальном носителе вводят в бактериальную клетку. В процессе размножения бактерий получают огромное число копий гена.

Вектор — носитель (плазмида или бактериофаг), в который может быть введена чужеродная ДНК с целью клонирования.

Плазмида — небольшая кольцевидная двухцепочечная ДНК, которая реплицируется независимо от ДНК хозяина.

Принципиальный подход к клонированию генов (рис. 19.3): в плазмиде создают дефект (брешь) с помощью рестриктазы. С помощью этой же рестриктазы вырезают участок ДНК с нужным геном. На рисунке приведены последовательности, распознаваемые рестриктазой EcoR1, и указаны сайты, где этот фермент производит «разрезание» ДНК. Благодаря образующимся «липким концам» происходит включение чужеродной ДНК в вектор, ДНК-лигаза восстанавливает целостность плазмиды, и образованная гибридная молекула помещается в бактериальную клетку.

Рис. 19.3. Генная инженерия. Получение рекомбинантной ДНК

Экспрессия гена, включенного в плазмиду, приводит к образованию бактериями нужного белка, его можно выделить и использовать. Технологии рекомбинантных ДНК позволяют получать для медицинской практики вакцины, лекарственные препараты белковой природы (инсулин, соматотропный гормон, интерфероны, эритропоэтин , тканевый активатор плазминогена и др.).