Ингибиторы биосинтеза белка

Ингибитор	Механизм действия
Антибиотики
Доксорубицин Актиномицин D	Внедряются между парами оснований ДНК и нарушают раскручивание цепей (репликацию и транскрипцию)
Рифампицин	Ингибирует РНК-полимеразу прокариот
Стрептомицин	Ингибирует инициацию трансляции (связываясь с 30S-субъединицей)
Тетрациклины	Блокируют поступление аа-тРНК в А-центр
Левомицетин	Ингибирует пептидилтрансферазу
Эритромицин	Подавляет транслокацию
Токсины
α-Аманитин	Ингибирует РНК-полимеразу II эукариот
Рицин	Катализирует распад рРНК большой субъединицы рибосом эукариот
Дифтерийный токсин	Подавляет транслокацию рибосом (модифицирует EF-2)

Тема 19. Современные методы молекулярной биологии

Основными инструментами в работе молекулярного биолога с нуклеиновыми кислотами являются ферменты. Используют рестриктазы (эндонуклеазы, которые узнают специфические последовательности в ДНК и разрезают молекулу ДНК в этом месте), ДНК-полимеразы (в том числе, РНК-зависимую ДНК-полимеразу), ДНК-лигазы, экзонуклеазы и другие.

Исследование последовательности нуклеотидов днк (метод Сэнджера)

Метод основан на моделировании ДНК-полимеразной реакции, где исследуемая молекула ДНК (с неизвестной последовательностью нуклеотидов) используется в качестве матрицы (рис. 19.1). В модельную систему входят: одноцепочечный фрагмент исследуемой ДНК (матрица), небольшой затравочный олигонуклеотид (праймер), субстраты для синтеза дочерней цепи (дНТФ четырех типов: дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ) и фермент ДНК-полимераза. ДНК-полимераза ведет синтез дочерних цепей комплементарно матрице. Для остановки синтеза протокол секвенирования, предложенный Ф. Сэнджером, предполагает использование 2^/, 3^/-дидезоксинуклеотидов (ддНТФ). После включения такого нуклеотида дальнейшее наращивание цепи невозможно из-за отсутствия свободной ОН-группы в 3^/-положении пентозы.

Реакция проводится одновременно в четырех отдельных пробирках, в каждой из которых содержатся все 4 дНТФ и один тип ддНТФ. В примере, приведенном ниже, по окончании реакции все фрагменты, синтезированные ДНК-полимеразой в первой пробирке, будут заканчиваться на Г, во второй — на А, третьей — на Т, в четвертой — на Ц.

Рис. 19.1. Протокол секвенирования по Сэнджеру

Во все пробы добавляют радиоактивно меченый «нормальный» дНТФ, либо используют меченый праймер, чтобы можно было по окончании синтеза обнаружить продукты реакции. Разделяют полученные фрагменты методом электрофореза в геле, при этом небольшие синтезированные молекулы проходят дальше, а крупные остаются ближе к линии старта (вверху). После ауторадиографии (проявки геля) «читают» полученную электрофореграмму снизу вверх и определяют, в какой последовательности ДНК-полимераза включала нуклеотиды в растущую цепь. Последовательность нуклеотидов в исследуемой молекуле ДНК легко установить (она комплементарна той, которую синтезировала ДНК-полимераза).

В настоящее время можно проводить реакцию в одной пробирке, используя флюоресцентные метки разных цветов для четырех типов ддНТФ. Методика автоматизирована и позволяет быстро и эффективно расшифровывать довольно большие геномы.