77. Селективный скрининг на нбо

Просеивание континентов повышенного риска, в котором ожидается накопление исследуемой болезни обмена. Начальные тесты с мочой, полуколичественные и количественные тесты. Самый полезный материал для выявления возможного метаболического нарушения при нбо – хронометрированная и измерительная проба мочи. Моча собирается в течении 24 часов без консервантов. Цветные реакции: цпх тесты – выделение таг-электрофорез, тест бенедикта на редуцирующие вещества - тонкослойная хромотография – количественное определение выделение сахара, тест с нитропрусидом – количественное определение цистина и гомоцистина.

78. Методы подтверждающей диагностики нбо

Методы ДНК диагностики

Количественный анализ: а\к на а\к анализаторе, органических кислот, жк методом газожидкостной хромотографии.

Методы энзимодиагностики лизосомных и митохондриальных болезней. Тандемная масс-спектрометрия. Общие принципы: 1) для определения всех известных а\к-32 2) из одного пятна крови 4) быстро 5) проведение уже на 3 день жизни 6) низкая частота повторов 7) по принципу 1 метод-несколько болезней 8) низкая стоимость.

79. Саузерн,ПЦР,Электрофорез.

Полимеразная цепная реакция (амплификация ДНК in vitro). Полимеразная цепная реакция (ПЦР) представляет собой ферментативный синтез фрагментов ДНК. В пробирке с помощью ДНК-полимеразы синтезируют цепочку ДНК, комплиментарную исходной молекуле-матрице. Реакционная смесь содержит, кроме фермента и матрицы 4 дезоксинуклеотид- трифосфата, и 2 короткие цепочки ДНК (праймеры), комплиментарные концам размножаемого участка. Реакционную смесь вначале нагревают, чтобы разделить двухцепочечную матрицу, затем охлаждают, чтобы праймеры связались с комплиментарной им последовательностью, и полимераза построила вслед за праймерами всю цепочку. Циклическое повторение нагревания и охлаждения приводит к экспоненциальному росту числа копий матрицы, поскольку каждая новая двухце- почечная копия вновь разделяется и сама служит матрицей для следующего цикла синтеза. За полтора часа можно провести 30 таких циклов, что приведет к увеличению числа копий нужного фрагмента в миллионы раз.

Большая скорость амплификации, точность и простота (что дает возможность полностью автоматизировать реакцию) выгодно отличают ее от технологии рекомбинантных ДНК. Однако ПЦР имеет и некоторые недостатки. Основные из них - необходимость иметь предварительную информацию б амплифицируемом участке (нужно знать последовательность праймеров) и невозможность амплифицировать большие фрагменты (больше нескольких тысяч и.о.).

Гель-электрофорез нуклеиновых кислот

фракционирование молекул ДНК или РНК по размеру в гелевом носителе под действием электрического поля

Носители - агароза или полиакриламид (ПААГ)

Акриламид СН₂=СН-СОNН₂

Агароза - фракция природного линейного полисахарида агара (-D-галактопираноза и ангидро--L-галактопираноза

В данном разделе будут рассмотрены вопросы ДНК-диагностики только моногенных наследственных болезней. ДНК- диагностика мультифакториальных заболеваний также активно разрабатывается, особенно в последние годы, но обычно она может быть эффективной лишь при тех патологических состояниях, для которых удается вычленить "главный" ген, мутации которого приводят к болезни; в этих случаях стратегия диагностики мультифакториальной патологии сходна с ДНК- исследованиями при моногенных болезнях.

Все разнообразие применяемых в настоящее время в молекулярной генетике подходов для идентификации определенных генов или определенных фрагментов ДНК и их вариаций основывается на двух основных методологических разработ-ках - технологиях блот-гибридизации и амплификации отдельных участков ДНК.

Методология блот-гибридизации используется уже более

20 лет без принципиальных модификаций. Принцип блот-гиб- ридизации ДНК по Саузерну показан на рис. 13. Анализ начинается с выделения ДНК из любой ядросодер- жащей ткани организма (из любого органа, ткани, культивируемых клеток). Обычно у обследуемого берется несколько мил-лилитров крови, а при пренатальной диагностике - амниоти- ческая жидкость или биоптат хориона. Выделенная клеточная ДНК обрабатывается одной из рестрикционных эндонуклеаз, расщепляющей ДНК в строго определенных сайтах. В результате получается характерный для данного человека набор из огромного множества фрагментов различной длины, которые при электрофоретическом фракционировании в агарозном или полиакриламидном геле располагаются в зависимости от их • молекулярного веса: чем меньше фрагмент, тем выше скорость его миграции в геле. На следующей стадии происходит сам Саузерн-блоттинг (названный по имени доктора из Эдинбурга Эдмунда Саузерна, предложившего метод, а английское blot - означает промокать): фрагмент ДНК переносится осмотическим током жидкости из влажного геля на помещенный на него нитроцеллюлозный или нейлоновый фильтр. На фильтре получается реплика ДНК-рестрикта. При переносе в щелочной среде ДНК денатурирует, то есть переводится в одноцепочечное состояние, в котором она может гибридизо- ваться с меченым ДНК-зондом на исследуемый ген или ДНК- фрагмент. В зависимости от способа мечения (радиоактивный или флуоресцентный) гибридные фрагменты, соответствующие изучаемой ДНК-последовательности, выявляются авто- радиографически или с помощью флуоресцентной метки.

81. Общие закономерности этиологии и патогенеза генных болезней.

Генные болезни — разнородная по клиническим проявлениям группа заболеваний, обусловленных мутациями на генном уровне.

У человека описаны следующие виды генных мутаций, обусловливающие наследственные болезни: миссенс, нонсенс, сдвиг рамки считывания, делеции, вставки (инсерции), нарушения сплайсинга, увеличение числа (экспансия) тринуклеотидных повторов. Любой из этих видов мутаций может вести к наследственным болезням. Даже одна и та же генная болезнь может быть обусловлена разными мутациями.

Начало патогенеза любой генной болезни и его «ключевая точка» связаны с первичным эффектом мутантного аллеля, поэтому принципиальные звенья патогенеза генных болезней можно представить следующим образом: мутантный аллель -» патологический первичный продукт (качественно или количественно), цепь последующих биохимических процессов -» клетки -» органы -» организм. Это и есть главная общая закономерность развития генных болезней при всём их многообразии.

В зависимости от контролируемого конкретным геном продукта и от характера нарушения его при мутации соответствующим образом развёртывается патогенез болезни на молекулярном уровне.

Если в результате мутации будет вырабатываться избыточное количество продукта, то патогенез болезни в целом будет обусловлен именно усиленной генной активностью (еще не обнаружен в конкретных формах наследственных болезней). При другом варианте патологического эффекта мутантного гена синтезируется аномальный белок. За этим следуют нарушения той системы (клетки, органа), функции которой обеспечиваются нормальным белком (серповидно-клеточная анемия). Третий вариант патологического эффекта мутантного аллеля — отсутствие выработки первичного продукта. Чаще всего. Нарушается тот или другой процесс из всего комплекса нормального биохимического гомеостаза. Это выражается в накоплении токсичных продуктов-предшественников (фенилкетонурия). Известен и четвёртый вариант первичного патологического эффекта мутантно-го аллеля — выработка уменьшенного количества нормального первичного продукта (бетта-талассемия, акаталазия). Патогенез таких заболеваний отличается большой вариабельностью, поскольку наряду с нормальным путём обмена веществ будут протекать и патологические процессы.

82. Груз наследственной патологии в мед и соц аспекте. Оценка тяжести мед и соц последствий.

Наследственная патология определяется грузом мутаций, вновь возникающих и унаследованных из предыдущих поколений. Эффекты мутационного процесса для популяций человека выражаются в медицинском и социальном значениях.

Медицинские последствия мутационного груза - повышенная потребность в медицинской помощи и сниженная продолжительность жизни больных. Болезнь требует большого объёма медицинской помощи и постоянного лечения. Основные виды медицинской помощи следующие: при врождённых пороках развития - детская хирургия; при хромосомных болезнях - социальная поддержка: при генных болезнях — медицинское лечение и социальная поддержка.

Продолжительность жизни больных с наследственной патологией зависит от формы болезни и уровня медицинской помощи.

О социальной и медицинской значимости профилактики наследственных болезней говорят факты социальной дизадаптации (инвалидности) больных, а также экономические затраты на их содержание. Наряду с медицинской и социальной значимостью профилактики наследственных болезней не менее важным являются психологические аспекты в семье при наличии больного ребёнка. Необходимость профилактики наследственных болезней диктуется и популяционными закономерностями их распространения. Такие болезни передаются из поколения в поколение. При улучшении медицинской помощи такие больные будут не только дольше жить, что автоматически повышает число больных с наследственной патологией в популяции, но и передавать мутации от поколения к поколению.

Регистр для общей наследственной патологии. Этапы:

1. Выявление больных с высоким риском (более 10%). Методы: прямой (срининг или рутинная диагностика в поликлиниках и стационарах) и непрямой (сведения из других регистров и картотек, таких как амбулаторные карты, истории болезни).

Подсчет риска рождения пораженных детей у лиц, включенных в регистр, на основе генетических методов расчета или эмпирических данных.

3. Совершенствование методов наблюдения и контакта с лицами, имеющими высокий риск рождения больного ребенка