54. Детекция точечных мутаций.

Прямая детекция мутаций возможна и для нуклеотидных мутаций ДНК, изменяющих сайты узнавания соответствующих рестриктаз. Пример приведен на рис. 19. При серповиднокле- точной анемии, вследствие мутационной замены в 6 кодоне гена [з-гемоглобина аденина (А) на тимин (Т), нормальная нук- леотидная последовательность, узнаваемая ферментом Mst II (CCTNTGG), изменена на последовательность, уже не распознаваемую данным ферментом (CCTNAGG). В норме (р^а) рестрикцией и гибридизацией с ДНК-зондом в данном регионе гена выявляется фрагмент длиной 1.15 Кб, тогда как при описанной мутации Саузерн-блотом определяется фрагмент (р⁵) размером 1.35 Кб. Таким образом, при блот-гибридизации могут быть четко дифференцированы нормальные гомозиготные индивиды (АА), гетерозиготы (AS) и гомозиготы по серпо- видноклеточной мутации (SS); при этом каждый из трех генотипов может быть точно определен.

Следующий подход к ДНК-диагностике - аллель-специфическая амплификация (или в другом варианте - гибридизация) нормальной и мутантной^ДНК-последовательности проиллюстрируем на исследовании одной из основных мутаций в гене фенилаланингидроксилазы (R408W: однонуклеотидная мутация приводит к замене в белковом продукте кодируемой аминокислоты), приводящей к фенилкетонурии (Dvorakova D. et al1993). Для исследования используются два ДНК-праймера_} фланкирующих исследуемый 12-ый экзон гена (праймеры А и В), а также олигонуклеотидные праймеры, комплиментарные нормальной (праймер S) и мутантной последовательности (прай- мер М) в локусе 408 (рис. 20).

55. Методы анализа конформационного полиморфизма одноцеп.Днк и гетеродуплексного анализаэ

Очень большая часть ДНК-дефектов в генах связаны с точечными мутациями: нуклеотидными заменами, делециями, дупликациями. Например, точечные мутации лежат в основе 95% нарушений гена фактора свертываемости VIII (гемофилия А) (Berg et а/., 1992), подавляющее большинство известных к настоящему времени более чем 60G мутаций (Estivill, 1996) в гене CFTR (ген трансмембранного белка муковисцидоза) - это также точечные (нуклеотидные) мутации. При том, что эти мутации в каждом конкретном случае при многих заболеваниях могут затрагивать разнообразные регионы гена, понятно, что столь мелкие изменения ДНК не так легко определить. Поэтому выбираемый подход анализа зависит, в первую очередь, от целей исследования {Rolf et al., 1992): а) определение известных нуклеотидных мутаций в определенном фрагменте гена 6) проведение скрининга отдельных участков гена на наличие точковых мутаций; в) необходимость точного определения мутаций в анализируемом фрагменте;д) определение всех присутствующих мутаций и т.д. Разрабатывается много различных экспериментальных процедур подобных исследований. Спектр их постоянно пополняется. Из очень перспективных и довольно результативных (эффективных) опишем здесь основы поиска единичных нуклеотидных мутаций в генах или ДНК-фрагментах через изучение конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов ДНК и гетеродуп- лексный анализ.

Метод анализа конформационного полиморфизма одноце- почечной ДНК (single strand conformation polymorphism) - SSCP- анализа - основывается на различной подвижности однони- тиевых ДНК-структур в неденатурирующем полиакриламидном геле, зависящей от их первичной нуклеотидной последовательности. Анализируемый фрагмент (рис. 21) амплифицируется в ходе ПЦР. Затем продукт реакции подвергается термической денатурации (при +95°С) в присутствии формамида и быстрому охлаждению, препятствующему реассоциации нитей ДНК. Далее проводится электрофорез в полиакриламидном геле и подвижность исследуемого ПЦР-продукта сравнивается с подвижностью аналогичных нормальных вариантов денатурированной ДНК (или с подвижностью ДНК-вариантов с известной нуклеотидной последовательностью). Наличие внутри исследуемой цепи ДНК одной точечной мутации уже приводит и изменению электрофоретических характеристик вследствие изменения вторичной структуры фрагмента ДНК в геле. Фрагменты одной длины, но разные по последовательности, имеют разные скорости миграции в ходе электрофореза. Таким образом, в SSCP-анализе, детекция мутантной последовательности основана на различиях миграции в геле вследствие изменения конформации ДНК.

Гетеродуплексный анализ фрагментов ДНК также позволяет выявлять мелкие (нуклеотидные) мутации в последовательностях ДНК.

При данном подходе анализируемый фрагмент гена амплифицируется в реакции ПЦР, а затем создаются условия для образования гетеродуплексов между различными аллелями, имеющими единичные расхождения в последовательности нуклеотидов. Для этого амплификаты денатурируют при +95°С, а затем медленно охлаждают. При этом происходит реассоциация молекул ДНК, в том числе двойные цепи ДНК образуются не только между идентичными однонитиевыми фрагментами, но и не полностью комплиментарными ДНК-последовательностями. Так, при наличии в смеси ПЦР-продуктов разных аллелей гетеродуплек- сы формируются между диким типом (нормальным вариантом) и мутантной ДНК. Гетеродуплексные молекулы, вследствие нарушения их вторичной конфигурации, имеют, обычно, меньшую подвижность в гидролизующем полиакриламидном геле (ПААГ), чем соответствующие гомодуплексы, и выявляются по изменению расположения ДНК-фрагментов в геле {Prior et а/., 1993). Основные этапы гетеродуплексного анализа показаны на рисунке 22. Среди преимуществ гетеродуплексного анализа следует выделить его высокую чувствительность в определении замен одного основания, возможность быстрого обследования (скринирования) на наличие потенциальных мутаций в различных областях исследуемых генов.

Конечно, в идеальном варианте все подходы к выявлению аномального поведения при электрофорезе, связанные с изменением в нуклеотидных последовательностях (кроме описанных используют еще анализ фрагментов в денатурирующих гелях и др.), должны завершаться секвенированием гена или его фрагментов для точного описания мутаций. Описанные методы не исчерпывают всех подходов к прямой диагностике наследственных болезней. В определенных ситуациях, если известно, что заболевание связано с малым количеством потенциальных мутаций, возможна интенсификация молекулярного анализа. Например, для скрининга на ограниченный в ряде популяций круг мутаций при муковисци- дозе применяют обратную дот-блот-гибридизацию: в реакции гибридизации тестируются меченые амплифицированные фрагменты ДНК с иммобилизованными олигонуклеотидами, соответствующими нормальному и мутантному аллелю.