40. Картирование и секвенирование.

Ферментативное секвенирование ДНК. Сэнгер, 1977. Субклонир фрагм ДНК из космид → спец векторы→ послед нуклеотидов. Способы визуализайии: меченые праймеры, цепи ДНК, терминалов. В каждой проб отнош dNTP такое, чтобы синтезир набор фрагментов включ в каждую позиц дан осн. Фрагм в геле по длинне.

Генетич картирование - поиск места располож в геноме гена или генетического маркера на основ его наслед в родословных по косегрегации генами/маркерами известной локализации. Непрямой метод, т.к. основ на корреляции между призн и уч хр при передаче в ряду поколений или клеточных клонов. Анализ генетического сцепления гена или маркера неизв локализ с геном или маркером изв локализ. Генетич расст между сцепл маркерами измер 1% рекомбинации = 1 сМ. По частоте рекомбинации судят о расстоянии между маркерами.

41. Карты генетического сцепления

Генетические карты показывают относительное располо­жение на хромосоме генов и других маркеров. Любой насле­дуемый признак, будь то цвет глаз или различия в длине фраг­ментов ДНК, потенциально может служить генетическим мар­кером. Единственные требования к маркеру - межиндивиду­альные различия по нему и легкость выявления этих различий. Маркерами могут быть как экспрессируемые участки ДНК (гены), так и некодирующие последовательности, наследова­ние которых можно проследить.

Для того, чтобы маркер можно было использовать при кар­тировании, он должен быть полиморфным, т.е. должны сущест­вовать альтернативные формы признака, которые можно было бы легко различить и описать у членов семьи. Полиморфизм ДНК - довольно распространенное явление. В среднем, пос­ледовательность ДНК двух случайно выбранных людей будет различаться по одному из каждых 300-500 нуклеотидов. Вари­ации ДНК в экзонах могут приводить к изменениям структуры белка и проявляться в виде внешних фенотипических призна­ков, например, в различиях по группе крови или предрасполо­женности к той или иной болезни. Поскольку экзоны занима­ют лишь небольшую часть генома, большинство различий в последовательности ДНК сосредоточено в интронах и не про­является во внешних фенотипических признаках. В то же вре­мя эти изменения легко определяемы на уровне ДНК и тоже могут использоваться как маркеры. Примерами таких марке­ров, где признаком служат сами характеристики последова­тельности ДНК, являются полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) и полиморфизм по числу тандемных пов­торов.

ПДРФ является результатом полиморфизма ДНК в местах (сайтах), которые можно разрезать рестрикционными фермен­тами. Сайты узнавания рестрикционными нуклеазами - корот­кие (как правило, 4-6 членные) строго определенные после­довательности нуклеотидов, в которых происходит разреза­ние ДНК рестриктазой. В результате образуется набор фраг­ментов ДНК определенной длины. Любое изменение сайта узнавания (вставка, делеция или замена нуклеотида) приво­дит к тому, что он становится "невидимым" для фермента, молекула ДНК не разрезается в этом месте и образуется дру­гой набор фрагментов. Второй тип ДНК-маркеров - полимор­физм по числу тандемных повторов - является результатом межиндивидуальных различий по числу копий коротких повто­ряющихся последовательностей ДНК, что проявляется в раз­личиях по длине данного участка ДНК.

Карты генетического сцепления строят на основе совмест­ного наследования генов или маркеров. Два маркера, распо­ложенные на одной хромосоме вблизи друг от друга имеют тенденцию передаваться от родителей ребенку совместно. Во время нормальных процессов развития сперматозоидов и яй­цеклеток, цепочка ДНК случайным образом разрывается и вос­соединяется в различных местах той же хромосомы или ее копии (т.е. гомологичной хромосомы). Этот процесс, называ­емый мейотической рекомбинацией, может приводить к раз­делению двух маркеров, первоначально расположенных на одной хромосоме. Чем ближе расположены маркеры друг к

другу - чем "теснее" они сцеплены, тем менее вероятно, что процесс рекомбинации разделит их. Таким образом, по час­тоте рекомбинации можно оценить расстояние между двумя маркерами.

На рисунке 3 проиллюстрирован принцип построения кар­ты генетического сцепления. Вертикальные линии на диаграм­ме изображают пары 4 хромосомы у каждого из членов семьи. У отца имеется два генетических локуса, ДНК-маркер М и ген хореи Гентингтона (ХГ), каждый из них можно обнаружить и у любого ребенка, который их унаследует. Один из детей унас­ледовал только маркер М, но не хорею Гентингтона, ген кото­рой располагался на той же отцовской хромосоме. Этот факт свидетельствует, что генетический материал отца рекомбини- ровал в процессе сперматогенеза. При наблюдении наследо­вания маркера М и хореи Гентингтона во многих семьях мож­но установить частоту, с которой происходит рекомбинация между этими локусами и установить расстояние между ними.

На генетической карте расстояния между маркерами из­меряются в сантиморганидах (сМ), названных так в честь американского генетика Томаса Ханта Моргана. Когда часто­та рекомбинации между двумя маркерами равна 1%, говорят, что они находятся на расстоянии 1 сМ. Генетическое расстоя-

ние в 1 сМ примерно равно физическои дистанции в 1 милли­он пар оснований (1 мегабаза (Мб)).

С помощью анализа сцепления на генетической карте можно локализовать и наследственные заболевания, гены которых или их молекулярные основы неизвестны. Генетическое картиро­вание помогло найти точное хромосомное расположение ге­нов многих важных болезней. Кроме уже упоминавшейся хо­реи Гентингтона, это - муковисцидоз, серповидно-клеточная анемия, болезнь Тея-Сакса, поликистоз почек, синдром лом­кой Х-хромосомы, миотоническая дистрофия и многие другие заболевания (см. главу 3).

Одна из ближайших промежуточных целей проекта «Геном человека» - построить генетическую карту человека с высо­ким разрешением (2-5 сМ) (на современных картах большин­ства хромосом маркеры расположены в среднем через каж­дые 7-10 сМ). Разрешение генетических карт можно увели­чить, используя технологию рекомбинантных ДНК, фрагмен­тацию хромосом под действием радиации и гибридизацию клеток (слияние клеток человека с клетками других видов) для создания панелей клеток, содержащих отдельные части хро­мосом человека. Оценивая, какие маркеры и как часто оста­ются совместно после радиационной фрагментации ДНК, мож­но установить порядок их расположения и расстояние между маркерами. Поскольку для анализа требуется лишь одна ко­пия хромосомы, этот метод может картировать и неполимор­фные маркеры.