42. Физическое картирование

Локализация генов при анализе генетического сцепления или межвидовой гибридизации клеток представляет собой не­прямые методы картирования, поскольку основывается на кор­реляции между признаком и хромосомой при передаче в ряду поколений или клеточных клонов. Молекулярная генетика, в особенности технология рекомбинантных ДНК, дает в руки исследователей инструмент, позволяющий работать с носи­телями генетической информации (хромосомами, молекула­ми ДНК, отдельными генами) непосредственно. Генетические карты, которые строятся на основе прямого исследования ге­нетического материала, называют физическими.

Различные методы физического картирования позволяют получить карты с различной степенью детализации. Общая закономерность такова, что чем более детальна карта, тем меньший участок генома можно картировать в ходе отдельно­го эксперимента. Карта с самым низким уровнем разрешения - хромосомная (ее иногда называют цитогенетической), которая отражает различия в окраске бэндов при наблюдении в световой микроскоп и позволяет охватить весь геном. Карта кДНК показывает расположение экспрессируемых участков (экзонов) на хромосомной карте. Более подробная карта кос- мидных контиг отражает локализацию наборов перекрываю­щихся фрагментов ДНК, охватывающих небольшие участки генома. Рестрикционные карты фиксируют порядок располо­жения на молекуле ДНК сайтов рестрикции и расстояние меж­ду ними. Самая подробная из физических карт - последова­тельность нуклеотидов. Однако, одномоментно можно секве- нировать лишь очень небольшие (по сравнению со всем гено­мом) фрагменты ДНК.

Мелкомасштабные физические карты

К мелкомасштабным картам (физическим картам с низким уровнем разрешения) относятся хромосомные карты и карты кДНК.

При определении положения гена на хромосоме первона­чально стоит задача приписать его к определенному хромо­сомному сегменту - бэнду или группе бэндов, который можно идентифицировать цитогенетически. Сейчас для этого исполь­зуют метод гибридизации in situ. Клонированную копию нуж­ного гена помечают радиоактивной (например, тритиевой или фосфорной) или флуоресцентной меткой. Меченый таким об­разом фрагмент ДНК называют зондом. Затем зонд инкубиру­ют с метафазным препаратом хромосом и, после того как он свяжется с комплиментарной цепочкой ДНК на интактнои хро­мосоме, устанавливают его точную локализацию. С помощью гибридизации in situ было картировано множество генов чело­века, в том числе гены альбумина, коллагена, альфа-глобина,

гормона роста.

До недавнего времени даже самые подробные из хромо­сомных карт позволяли локализовать фрагмент ДНК с точ­ностью до региона размером примерно 10 Мб (средний раз­мер хромосомного бэнда). Усовершенствования метода флу­оресцентной гибридизации in situ (FISH) позволили увеличить разрешение хромосомных карт до 2-5 Мб. Модификации ме­тодов гибридизации, использующие хромосомы на стадии интерфазы, когда они менее компактны, дают возможность локализовать зонд до участка размером в 100000 п.о. (0,1 Мб).

Карта кДНК отражает расположение на хромосоме кодиру­ющих последовательностей. ДНК-копию (кДНК) синтезируют в лаборатории, используя в качестве матрицы молекулы мРНК, вносят метку и локализуют кДНК-зонды методом гибридиза­ции in situ. Представляя экспрессируемые участки, кДНК поз- воляет выявить наиболее значимые с биологическои и меди­цинской точек зрения районы генома. Карта кДНК может по­мочь в хромосомной локализации генов, функция которых еще неизвестна. ДНК-копию можно получить и в том случае, если белок синтезируется в очень небольших количествах и выде­лить специфическую мРНК из общей смеси мРНК клетки не удается. Зная последовательность аминокислот в белке, мож­но «воссоздать» последовательность гена искусственно или выделить его из клонированной геномной ДНК при гибриди­зации со смесью олигонуклеотидов, соответствующих всем возможным кодирующим последовательностям гена (вслед­ствие вырожденности генетического кода их может быть не­сколько).

Крупномасштабные физические карты

Существует два общих подхода к построению физическои карты участка генома с высоким уровнем разрешения: карти­рование "сверху вниз" (макрорестрикционная карта) и снизу вверх" (карта контиг). В обоих случаях карта представляет со­бой упорядоченный набор фрагментов ДНК. Фрагменты раз­множают клонированием или с помощью полимеразнои цеп­ной реакции, разделяют гель-электрофорезом и выявляют при окрашивании или гибридизации с меченым зондом. Для вос­создания оригинальной последовательности фрагментов (той последовательности, в которой они находятся в геноме) ис­пользуют различные методы поиска перекрывающихся участ-

КОВ

Методы физического картирования можно применять к изо­лированным хромосомам человека. Отдельные изолированные хромосомы получают путем сортировки хромосом в потоке (метод проточной цитометрии) по их размеру. Существуют также гибридные клеточные линии, содержащие отдельные хромосомы человека. Для получения таких линий клетки чело­века гибридизуют с опухолевыми клетками млекопитающих (как правило, грызунов). В процессе деления гибридные клетки теряют предпочтительно хромосомы человека. Когда в гио- ридной клетке останется лишь одна человеческая хромосома, ее размножают и поддерживают как клеточную линию.

Необходимой ступенью при построении крупномасштабных физических карт является получение большого количества фрагментов ДНК картируемого участка. Существует два ос­новных способа амплификации ("размножения ) ДНК - клони­рование и амплификация в полимеразной цепной реакции.