57. Генетика мфз. Полигены, среда.

Eсть большая и нозологически разнообразная группа болезней, развитие которых определяется взаимодействием определённых наследственных факторов (мутаций или сочетаний аллелей) и факторов среды. Эту группу болезней называют болезнями с наследственной предрасполо-женностью. индивидуальные комбинации аллелей невероятно многообразны.Они обеспечивают генетическую уникальность каждого человека, которая выражается не только в способностях, физи-

ческих отличиях, но и в реакциях организма на патогенные факторы окружающей среды. Болезни с наследственной предрасположенностью возникают у лиц с соответствующим генотипом (сочетание «предрасполагающих» аллелей) при провоцирующем действии факторов среды. Наследственная предрасположенность к болезни может иметь полигенную или моногенную основу. Моногенная наследственная предрасположенность определяется одним геном, т.е. связана с патологической мутацией данного гена, но для патологического прояв-ления мутации требуется обязательное действие внешнесредового фактора (как правило, не одного, а нескольких), который обычно точно идентифицируется и по отношению к данной болезни может рассматриваться как специфический.

Полигенная наследственная предрасположенность определяется сочетанием аллелей нескольких генов. Каждый аллель в отдельности скорее нормальный, чем патологический. Предрасполагает к болезням определённая их комбинация. Идентификация этих генов и их аллелей весьма затруднена. Свой патологический потенциал они проявляют вместе с комплексом нескольких внешнесредовых факторов. Это мультифакториальные болезни. Соотносительная роль

генетических и средовых факторов различна не только для данной болезни, но и для каждого больного. Болезни с наследственной предрасположенностью с определённой долей условности можно подразделить на следующие основные группы: 1) врождённые пороки развития; 2) распространённые психические и нервные болезни; 3) распространённые болезни среднего возраста.

58.Проблемы генетич.Картирования мфз

К фенотипам, которые не проявляют моногенного доминантного или рецессивного типов наследования, применяют термин "комплексные" или "сложнонаследуемые" признаки (т.е. термин "сложнонаследуемый признак" является более общим по отношению к термину "мультифакториальный признак"). В чем же заключается сложность этих состояний? В общем, осложнения возникают всегда, когда нарушается простое соответствие между генотипом и фенотипом: либо один и тот же

генотип в результате средовых влияний или взаимодействия с другими генами дает разные фенотипы, либо различные генотипы проявляются одинаковым фенотипом.

В числе основных проблем, затрудняющих генетическое картирование сложнонаследуемых признаков и мультифакто- риальных заболеваний (МФЗ) (этот список далеко не полный) можно выделить следующие (Weissman, 1995; Ландер, 1990; Lander и Schork, 1994)\

Генетические взаимодействия (полигения). Клинический фенотип может быть результатом действия нескольких (многих) генетических локусов. Вклад каждого индивидуального гена в общую картину формирования признака может быть очень небольшим. Полигенные признаки можно подразделить на дискретные, характеризующиеся наличием или отсутствием определенного состояния (например, развития сахарного диабета или инфаркта миокарда), и количественные, которые описываются непрерывным рядом изменчивости (например, уровень липидов плазмы, давление крови или концентрация глюкозы) и определяются совокупным аддитивным эффектом многих индивидуальных генетических локусов (QTL - локус количественного признака). В свою очередь, дискретные полигенные признаки могут быть результатом "порогового эффекта" лежащего в их основе количественного признака, либо результатом одновременного и совокупного действия мутаций нескольких локусов. Примеры первого варианта - инсулин-зависимый сахарный диабет (ИЗСД), гипертония; второго - одна из форм пигментного ретинита, требующая наличия мутаций в двух локусах, кодирующих белки сетчатки (Kajiwara etal., 1994).

Генетическая гетерогенность. Одна и та же фенотипи- ческая картина может иметь причину в мутациях различных генетических локусов - например, мутация, нарушающая функцию любого из генов, контролирующих определенную метаболическую цепочку, приведет к отсутствию или уменьшению концентрации конечного продукта этой цепочки. Генетическая гетерогенность - явление характерное практически для любого наследственного заболевания человека, в том числе для МФЗ. Последствия генетической гетерогенности с точки зрения картирования заключаются в том, что болезнь может ко- сегрегировать с определенным генетическим маркером в одной родословной и совершенно с другим - в другой. От собственно генетической гетерогенности (гетерогенности локусов) следует отличать аллельную гетерогенность, когда различные мутации одного локуса затрагивают одну и ту же функцию, но в разной степени и с разными клиническими послед-ствиями. Аллельная гетерогенность, в отличие от локусной, не является затруднением для генетического картирования.

Неполная пенетрантность, вследствие чего не все носители мутантного генотипа проявляют фенотип, отличный от нормы. Мутантный ген может проявиться клиническим фенотипом лишь с определенной, отличной от единицы, вероятностью. Эта вероятность может определяться как генетическим окружением ("фоном"), так и негенетическими причинами - полом, возрастом, средовыми влияниями. Тем самым, с определенной вероятностью, мутантный аллель может присутствовать у здоровых людей, а нормальный аллель - у больных.

Наличие фенокопий. Носители нормального генотипа могут проявлять мутантный фенотип по причинам негенетического характера.

Неменделевские механизмы передачи генетической информации. В последние годы стало очевидно, что наследование по Менделю - лишь один из вариантов механизма передачи генетической информации. Сейчас описано множество болезней, в основе которых лежит митохондриальное наследование, экспансия тринуклеотидных повторов, явление геномного импринтинга.

Высокая частота в популяции аллеля, связанного с болезнью. Нежелательные последствия высокой частоты аллеля для картирования заключаются в том, что в родословной может присутствовать несколько копий одного и того же аллеля, но разного происхождения. Например, попытки картировать генетический локус болезни Альцгеймера методом анализа сцепления в родословных долгое время были неудачными. Причина этого стала очевидной, когда выяснилось, что основным генетическим фактором болезни является аллель Е4 гена аполипопротеина Е, который в европеоидных популяциях встречается с довольно высокой частотой (15-20%) Редкость заболевания (очень низкая частота аллеля, связанного с болезнью). При отсутствии родословных с несколькими больными индивидами болезнь просто невозможно изучать методами генетического анализа.

Кроме этих общих проблем генетического картирования сложно наследуемых признаков существуют и более специфические, связанные с методами набора материала и картирования. Скажем, для генетического анализа очень важна правильная постановка диагноза. Ошибки в клинической диагностике, особенно характерные для случаев, когда диагностика основывается на критериях, далеких от физиологических основ болезни (например, при психических заболеваниях), могут привести как к ложно-позитивной, так и ложно-негативной

Высокая частота в популяции аллеля, связанного с болезнью. Нежелательные последствия высокой частоты аллеля для картирования заключаются в том, что в родословной может присутствовать несколько копий одного и того же аллеля, но разного происхождения. Например, попытки картировать генетический локус болезни Альцгеймера методом анализа сцепления в родословных долгое время были неудачными. Причина этого стала очевидной, когда выяснилось, что основным генетическим фактором болезни является аллель Е4 гена аполипопротеина Е, который в европеоидных популяциях встречается с довольно высокой частотой (15-20%) Редкость заболевания (очень низкая частота аллеля, связанного с болезнью). При отсутствии родословных с несколькими больными индивидами болезнь просто невозможно изучать методами генетического анализа.

Кроме этих общих проблем генетического картирования сложно наследуемых признаков существуют и более специфические, связанные с методами набора материала и картирования. Скажем, для генетического анализа очень важна правильная постановка диагноза. Ошибки в клинической диагностике, особенно характерные для случаев, когда диагностика основывается на критериях, далеких от физиологических основ болезни (например, при психических заболеваниях), могут привести как к ложно-позитивной, так и ложно-негативной

классификации индивидов, что одинаково отрицательно сказывается на перспективе картирования. Даже в тех случаях, когда найдены значимые корреляции между признаком и генетическим маркером, дальнейший анализ может быть затруднен чисто физическими причинами. Например, "подозреваемый" регион генома может оказаться слишком большим, а значит, недоступным современным методам физического картирования. Такая ситуация сложилась сейчас с несколькими локусами ИЗСД - их место на генетической карте определено, однако эффективное физическое картирование пока невозможно (Todd, 1995).

Затруднения иного рода возникают, если кандидатный ген оказывается сцепленным с другим кандидатным геном. Эта ситуация характерна для генетического картирования многих аутоиммунных заболеваний, основные генетические локусы которых расположены в районе главного комплекса гистосов- местимости. Здесь, на участке размером всего 3 Мб, расположены гены 10 семейств, функционирующих в иммунном процессе (Wei et ai, 1993), и разобраться в этом комплексе сцепленных локусов крайне сложно.

59. подходы к картированию МФЗ (методIBD,анализ ассоциации)

Современные методы картирования сложнонаследуемых признаков и МФЗ включают 4 категории: анализ сцепления, основанный на проверке конкретной модели наследования болезни в родословных; метод идентичных по происхождению (общих) аллелей, который заключается в оценке того, насколько часто больные родственники наследуют идентичный участок генома; исследования ассоциаций в популяциях и семьях и генетический анализ скрещиваний модельных организмов. Метод идентичных по происхождению

аллелей (IBD)

Классический анализ сцепления является параметрическим методом, т.е. основывается на заранее задаваемых характеристиках, таких как способ наследования и уровень пенетран- тности. Неверно заданные параметры могут привести, соответственно, и к неверным выводам. Скажем, неверно заданный тип наследования приводит обычно к переоценке реком- бинантной фракции (Ott, 1991; Terwilliger and Ott, 1994). При IBD-анапизе информацию о сцеплении получают только на основе наследования маркеров в парах больных родственников без априорных предположений о типе наследования и других характеристиках. Такой непараметрический подход менее строг и, вероятно, более продуктивен: больные родственники должны показывать избыток общих аллелей даже при неполной пенетрантности, наличии фенокопий, генетической гетерогенности и высокой частоте аллеля болезни.

Метод общих аллелей заключается в оценке того, насколько чаще по сравнению со случайной сегрегацией пара больных родственников наследует одну и ту же (идентичную по происхождению, IBD - identical by descent) копию участка генома (рис. 10). Скажем, в парах дед-внук, дядя-племянник или в случае полусибсов эти пары родственников могут иметь 0 или 1 общий по происхождению аллель по каждому локусу. Вероятность иметь общий аллель (или IBD-статистика, _ttR) при случайной менделевской сегрегации равна 1/2. Если же маркерный локус сцеплен с болезнью, пары больных родственни-ков должны иметь общий аллель чаще, чем в половине случаев. Значимость отличий при этом может быть оценена простым хи-квадрат тестом. Для количественного признака степень фенотипического сходства в парах родственников должна коррелировать с долей аллелей, идентичных по происхождению. Анализ общих по происхождению аллелей возможен для любых пар близких родственников, однако на практике чаще всего используют пары больных сибсов. IBD-анализ в сибсовых парах получил название ASP-метода (от affected sib- pairs). С помощью метода идентичных аллелей был картирован „один из локусов диабета типа 1 на длинном плече хромосомы 11 (Dawes etal., 1994), показано сцепление гипертензии с геном ангиотензина (Jeunemaitre et al., 1992, ревматоидного артрита - с локусом HLA (Hasstedt etal1994), поздней формы болезни Альцгеймера - с локусом на хромосоме 19 (Pericak- Vance et al., 1991), а гомосексуальной ориентации - с регионом Xq28 (Hamer etal., 1993). С появлением подробной генетической карты стало возможным использовать IBD-метод для сканирования всего генома. Такое сканирование было прове-дено пока лишь считанное число раз (Berrettini, 1994). Однако, это положение в ближайшем будущем явно изменится.

В теории метод IBD довольно прост. Однако, на практике ситуация выглядит несколько сложнее. Главным ограничением метода общих аллелей до недавнего времени была невозможность в некоторых случаях отличить аллели, идентичные по происхождению, от аллелей, идентичных по состоянию (IBS - identical by state). Другими словами, невозможно было определить, имеют ли два одинаковых аллеля общее происхождения, или мы имеем дело с двумя копиями аллеля разного происхождения.

Для преодоления этой трудности предлагались различные методы. Простейший заключается в том, чтобы ограничиться только теми парами родственников, для которых IBD-статус можно определить однозначно. Предлагалось также использовать ожидаемое значение IBD-статистики, рассчитываемое на основе данных по маркерам, IBD-статус которых определяется однозначно. Другой подход основан на использовании IBS-статистики вместо IBD (Weeks and Lange, 1988; Brown et al., 1994). Оба подхода на практике дают иногда хорошие результаты, однако их существенный недостаток в том, что они не используют всю имеющуюся информацию о наследовании маркеров, а, следовательно, теряют в продуктивности и мощности (Bishop and Williamson, 1990). Недавно предложен алгоритм, позволяющий извлечь всю возможную информацию из данного набора родословных (Kruglyak et al., 1995; Kruglyak and Lander, 1995). При этом для каждой точки генома на основе данных по маркерам и рекомбинантной фракции рассчитывается вероятность быть идентичной по происхождению в данной паре родственников. Этот алгоритм реализован в программном пакете MAPMARKER/SIBS (Kruglyak and Lander, 1995).

Хорошей иллюстрацией достоинств IBD-метода является работа Hugot и др. (1996) - один из первых примеров применения мультилокусного ASP-анализа сложнонаследуемого признака для сканирования всего генома. Им удалось картировать один из генов болезни Крона (регионального энтерита, MIM 266600) на хромосоме 16 между маркерами D16S409 и D16S419. Авторы использовали две независимые панели семей (всего 78 сибсовых пар) и 270 высокополиморфных маркеров, распределенных по всему геному. Первоначальный параметрический анализ сцепления не позволил картировать ген. Максимальный лод-балл (2.04 для локуса D16S409) был значительно ниже, чем предсказанный на основе аутосомно-ре- цессивной модели. ASP-анализ на этом же наборе родословных и маркеров позволил картировать предполагаемый генболезни Крона на хромосоме 16 на уровне значимости р<0.01 для обоих независимых панелей семей, несмотря на относительно небольшое увеличение относительного риска, связанное с этим локусом.

Интервал, в котором картирован ген болезни Крона, имеет размер около 4 Мб - он слишком велик для эффективного физического картирования. Современные технологии клонирования позволяют идентифицировать ген, если район его предполагаемой локализации ограничен 1 сМ, что приблизительно соответствует 1 Мб. Какова же "разрешающая способность" метода общих аллелей? Kruglyak and Lander (1995) оценили мощность IBD-метода для высокоразрешающего позиционного клонирования, сопоставив долю IBD-аллелей с уровнем относительного риска. Признак с очень высокой долей общих аллелей (Z_L) в сибсовых парах соответствует простому менделевскому (например, при Z_u=0.975, =40). Для картирования признака с Z_L=0.975 с уровнем разрешения в 1 сМ с 95% вероятностью достаточно 170 мейозов (43 сибсовых пары). Картирование признаков с x_s от 6 до 40 с таким же разрешением потребует примерно вдвое большую выборку семей. При дальнейшем уменьшении относительного риска и, следовательно, доли общих аллелей, требования к размеру выборки резко возрастают.

Ассоциации в популяциях и семьях

Исследования ассоциаций, в отличие от двух предыдущих методов генетического картирования, основаны не на анализе косегрегации генетического материала в семьях, а на поиске популяционных корреляций в частотах аллелей. В классическом случае они представляют собой сравнение больных индивидов со здоровыми из той же популяции. Генетический маркер (аллель данного гена) считается ассоциированным с болезнью, если его частота среди больных значимо выше, чем в контрольной выборке.

Исторически исследования ассоциаций сыграли решающую ^оль в выявлении генетической компоненты аутоиммунных и сердечно-сосудистых заболеваний. Анализ популяционных ассоциаций показал вовлеченность комплекса HLA в этиологию таких связанных с иммунными нарушениями состояний как диабет типа 1, множественный склероз, ревматоидный артрит, системная волчанка и позволил выявить роль наследственной вариабельности генов метаболизма липидов (аполипоро- теина В, рецептора липопротеинов низкой плотности, кластера генов аполипопротинов А1-СЗ-А4 и др.) в этиопатогенезе атеросклероза и нарушений липидного обмена (Breslow, 1988.;

Степанов и др., 1992; 1995). Из недавних примеров ассоциаций можно назвать исследования, показавшие ключевую роль гена АРОЕ в болезни Альцгеймера (Corder, 1993), и участие ангиотензин-конвертирующего фермента в этиопатогенезе инфаркта миокарда (Cambien et al., 1992). Применительно к моногенным признакам ассоциации успешно использовались для дальнейшего уточнения локализации гена, первоначально обнаруженного методами анализа сцепления. Такой подход применялся при картировании муковисцидоза, хореи Гентингтона, болезни Вилсона и др. (Jorde et al., 1994).

В основе ассоциации генетического маркера с болезнью могут лежать три причины. Во-первых, наличие ассоциации может свидетельствовать о том, что ассоциированный локус и есть ген или один из генов болезни. В этом случае следует ожидать, что положительная ассоциация будет иметь место во всех популяциях. Во-вторых, причиной ассоциации может быть неравновесие по сцеплению между маркерным локусом и локусом болезни. Это возможно в том случае, когда ассоциированный аллель находился на предковой хромосоме, а сам локус расположен достаточно близко к локусу болезни, чтобы эта корреляция не была нарушена рекомбинацией за время существования популяции. И, наконец, ассоциация может быть артефактом, возникшим вследствие подразделенности популяции.

Для целей генетического картирования важно отделить два первых случая от третьего. Этого можно добиться, исследуя ассоциации в гомогенных изолированных популяциях, используя внутрисемейный контроль или проводя тест на неравновесие при передаче - от гетерозиготных родителей к больным детям ассоциированный аллель должен передаваться чаще, чем неассоциированный (Julier et al.,1991).

Наиболее перспективны для идентификации генов комплексных состояний исследования ассоциаций на семейном материале (Thomson, 1995; Falk and Rubinstein, 1987). При этом контрольную популяцию аллелей составляют аллели здоровых родителей, которые не передаются больным детям. Этот подход называется AFBAC-методом (от английского Affected Family-Based Control) (рис. 11). В первой родословной родители имеют генотипы АВ и CD, а больной ребенок - генотип АС. Следовательно, аллели В и D, не передавшиеся потомку, составят контрольную популяцию. Для второй родословной в контрольную группу войдет аллель D. Если имеется большая выборка подобных родословных, можно сравнить частоты аллелей А, В, С и D у больных и в контрольной группе и выявить возможные ассоциации. Поскольку используются ядерные семьи, родительские аллели, несцепленные с геном или генами болезни, будут всегда сегрегировать независимо от аллелей гена предрасположенности к болезни. Тем самым, устраняются эффекты, связанные с подразделенностью популяции, и выявляются ассоциации только для маркеров, физически сцепленных с локусом болезни.

Исследования ассоциаций на ядерных семьях позволили подтвердить роль гена инсулина при сахарном диабете типа 1, для которого ранее были показаны ассоциации на популя- ционном уровне (Thomson etal., 1989), и помогли выявить маркеры, сцепленные с полипозом толстой кишки (Hastbacka et al., 1994). В принципе, AFBAC-метод вполне приемлем и для полного геномного скрининга, однако примеры таких исследований нам пока не известны.

Еще одной потенциально мощной стратегией генетического картирования является поиск ассоциаций в изолированных популяциях с небольшим числом основателей. Этот подход называется картированием с помощью неравновесия по сцеплению. Лежащая в его основе идея проста: чем более высокая степень генетической изоляции характерна для такой популяции, тем больше доля больных, унаследовавших ген болезни от общего предка, и, соответственно, тем больше вероятность, что причиной ассоциации является физическое сцепление маркера с геном болезни. Ассоциацию в изолированной популяции можно интерпретировать и с точки зрения метода общих аллелей. Все члены изолированной популяции являются, в определенной степени, дальними родственниками. Сравнивая частоту аллелей у больных и в контрольной группе, мы, тем самым, оцениваем долю общих аллелей у дальних родственников, используя не только мейозы в данном поколении, но и все мейозы в истории популяции. Сейчас в работах по картированию наиболее активно используется в качестве генетического изолята финская популяция. Стратегия картирования по неравновесию недавно была успешно применена для поиска гена диастрофической дисплазии (DTD) - моногеного менделевского заболевания. Традиционные методы анализа сцепления позволили локализовать ген DTD в районе размером 2 Мб, а затем анализ неравновесия по сцеплению в финской популяции сузил этот регион до 40 Кб, что позволило клонировать ген (Hastbacka etal., 1994). Подобная технология применима и для сложнонаследуемых состояний, хотя доля больных, имеющих общего предка, в этом случае должна быть меньше. Сейчас на финской популяции ведется картирование по неравновесию локусов подверженности к системной волчанке и некоторым другим заболеваниям (Krahe et al., 1996).