67. Метод флюоресцентной гибридизации in situ (fish).
Принцип этого метода состоит в следующем (схема 8.1).*
1.Для изучаемой хромосомы или конкретного её участка, исходя из специфичности последовательности оснований ДНК, готовят однонитевой участок ДНК, к которому присоединяется биотин или дигоксигенин. Такой «помеченный» участок ДНК называется зондом.
2.На микроскопическом препарате in situ при щелочной обработке хромосомная ДНК денатурируется, т.е. разрываются связи между двумя нитями ДНК.
3.Зондом обрабатывают препарат. Поскольку последовательность оснований ДНК-зонда и соответствующий участок хромосомы взаимно комплементарны, то зонд присоединяется к хромосоме. В этом участке происходит ренатурация ДНК.
4.После этого препарат обрабатывают веществом, которое благодаря своей структуре способно избирательно присоединиться к биотину или дигоксигенину. Как видно на схеме 8.1, для биотина таким веществом является стрептовидин, для дигоксигенина — антидигоксигениновое антитело. К этим веществам могут быть присоединены в один или два этапа флюоресцентные красители (родамин — красный цвет или флюоресцеин изотиоцианат — зелёный цвет).
5.С помощью люминесцентного микроскопа окрашенные хромосомы визуа-
лизируются на фоне неокрашенных.
Современные методические возможности позволяют увеличить число цветов. Границы применения метода FISH очень широкие: от локализации гена до расшифровки сложных перестроек между несколькими хромосомами. Следует подчеркнуть, что соединение молекулярно-генетических и цитологических методов делает почти неограниченными возможности диагностики хромосомных аномалий, как очень сложных, так и очень мелких по размерам. Дву- и трёхцветная флюоресцентная гибридизация in situ применяется для учёта симметричных хромосомных аберраций у лиц, облученных много лет назад ионизирующими излучениями. Указанный метод требует меньше времени, чем кариотипирование дифференциально окрашенных метафаз. В клинической цитогенетике метод FISH занимает всё большее место. В случаях сложных хромосомных перестроек, захватывающих более двух хромосом, дифференциальная G-окраска не всегда позволяет идентифицировать изменённые сегменты хромосом. В этих случаях применяют трёхцветный вариант
метода FISH. Например, у ребёнка с множественными врождёнными аномалиями при G-анализе обнаружены сложные перестройки в 6 хромосомах A,4, 7, 8, 9 и 12) с 10 разрывами. Полная идентификация разрывов возможна только с помощью /75У/-окраски.Метод FISH может применяться для диагностики анеуплоидий в интерфазных ядрах. Принцип метода в этом варианте такой же, как и для метафазных пластинок (описан выше). Например, специфичный для хромосомы 21 зонд ДНК, соединённый с биотином, гибридизируется с денатурированными клетками из амниотической жидкости на предметном стекле. В норме, т.е. если у плода есть дисомия по хромосоме 21, в ядре будут видны две флюоресцирующие соответствующим цветом точки. Если у плода трисомия, то в ядре будут видны 3 точки. Такой методический приём называют интерфазной цитогенетикой. Метод прост, экономичен и требует мало времени (несколько часов).
