43. Клонирование гена (векторы, космида,плазмида).

Арбер, Смит, 1970 Рестриктазы -ферменты бактер происх специфич расщепляющие молекулу ДНК в сайте с определ короткой последов нуклеотидов. Сайт рестрикции - место, распознав рестриктазой (4-8 п.н.). «Липкие» концы - короткие одноцепоч концы двухцепоч молекул ДНК, комплимент друг другу. Частота встреч сайтов рестрикции - (1/4)n, где n - длина сайта узнав. Сайты узнавания из 4 п.н. Встречаются в среднем 1 раз на 256 п.н., из 6 п.н. - 1 на 4096 п.н. из 8 п.н. - 1 на 65500 п.н. Мелкощепящие и крупнощепящие рестриктазы.Рекомбинантная мол ДНК - мол, содерж генетич материал разного происх. Плазмида - автономно реплицирующаяся внехр кольцевая мол ДНК (сущ в бакт кл). Несут гены устойч к антибиотикам, несущ в неселктивных усл, Некот способны к интеграции в геном. Вектор - рекомбинантная мол ДНК на основе самореплицир мол, в которую встроен фрагмент чужеродной (клонируемой) ДНК. Типы векторов для клонирования: Плазмиды (вставка до 5 т.п.н.). Космиды (векторы на основе фага лямбда, вставка до 50 т.п.н.). YAC иск хр дрожжей (до 1000 т.п.н.). BAC иск бакт хр. PAC иск хрфага P-1. Клонирование - процесс получ генетич идентичной группы кл (клона) из 1 первонач кл. Клонирование ДНК - процесс получ множества идент копий фрагмента ДНК или гена. 1. Рестрикция клонируемой ДНК и вектора тем же ферментом рестрикции 2. Инкубация вектора и фрагментов клонируемой ДНК и создание рекомбинантных молекул ДНК 3. Введение рекомбинантных векторов в бакт или дрожжевую кл 4. Отбор кл, несущ рекомбинантные мол (рост на селективных средах) 5. Рост культуры кл, несущих рекомбинантные векторы со вставками клонируемой ДНК – клонирование фрагментов ДНК. Библ ДНК - набор клонированных фрагментов ДНК. Существующая в виде культуры кл, несущих рекомбинантые векторы (набора клонов). Библ геномной ДНК - набор клонов, в которых представлены все фрагменты ДНК генома или его определенного участка. Библ кДНК - набор клонов, в которых представлены только кодирующие участки генома. Скрининг библ - поиск нужного клона (фрагмента ДНК). Зонд - одноцеп мол ДНК или РНК с опред последов оснований, несущая метку *гомологичные гены близких видов *гены того же генного семейства *искусственно синтезированне молекулы ДНК. 1. Посев культуры кл на чашку Петри и наращиване 2. Перенос ДНК из клонов на фильтр и денатурация ДНК 3-4. Гибридизация с зондом и выявление метки 5. Пересев нужного клона с чашки Петри в среду 6. Наращивание клона со вставкой в бактериальных кл 7. Вырезание вставки из рекомбинантного вектора с помощью рестриктазы 8. Анализ искомого фрагмента ДНК (секвенирование, поиск мутаций и т.д.)

44. СеквеннрованиеДнк

Секвенированием называют процесс выявления последо­вательности нуклеотидов ДНК. Современные процедуры секвенирования включают, во-первых, субклонирование фрагмен­тов ДНК из космид или библиотеки бактериофагов в специ­альные векторы для секвенирования, которые несут неболь­шие части клонированных фрагментов (рис. 7). Следующим шагом является преобразование субклонированных фрагмен­тов в набор молекул ДНК, различающихся по длине только на

один нуклеотид. Высокоразрешающие методы электрофоре­за позволяют разделить этот набор фрагментов и считать пос­ледовательность оснований. Каждая реакционная пробирка (для Т, С, G, А) при секвенировании дидеокси-методом (рис. 8) содержит:

ДНК-матрицу, прай- мер и ДНК-полимеразу для инициации синтеза новой цепочки в точке, где праймер гибридизу- ется с матрицей;

4 дезоксинуклеотид- трифосфата (dATP, dTTP, dCTP, dGTP), из которых синтезируется цепь ДНК;

один радиоактивно меченый дезоксинук- леотидтрифосфат;

один ди-дезокси- нуклеотидтрифосфат, при включении которо­го в цепочку ее рост за­вершается (в пробирке А это di-dATP, в пробир­ке С - di-dCTP и т.д.).

В каждой из пробирок соотношение dNTP и di- dNTP подобрано таким образом, чтобы синте­зировался набор фраг­ментов ДНК с di-dNTP, включенным в каждую позицию данного осно­вания на матричной ДНК. Набор фрагментов для каждого из нуклео- тидов затем разделяют в одном геле на четы­рех параллельных до­рожках. Фрагменты раз­деляются по длине: чем короче фрагмент (и, следовательно, чем ближе данное основа­ние к началу секвениру-

емого участка), тем быстрее он движется и тем ближе к концу геля он оказывается. Последовательность читают снизу вверх.

Хотя усовершенствования методов Максама-Гилберта и Сэнгера позволяют анализировать одновременно до 40 кло­нов на одном секвенирующем геле, эти технологии секвенио- вания (технологии первого поколения) не позволяют секвени- ровать большие участки генома - затраты времени и средств делают крупномасштабные проекты секвенирования с исполь­зованием этих методов неприемлемыми. Даже самое лучшее оборудование позволяет рабочей группе секвенировать толь­ко 50- 100 тысяч пар оснований в год при затратах 1 -2 долла­ра за п.о. При таких темпах на секвенирование всего генома человека (3 миллиарда п.о.) пришлось бы затратить 3000 лет и 3 миллиарда долларов.

Поэтому, одной из основных проблем, которые нужно ре­шить для построения подробной карты генома человека, яв­ляется разработка автоматизированных, быстрых и экономич­ных методов секвенирования. К технологиям секвенирования второго поколения относятся высоковольтный капиллярный электрофорез, позволяющий значительно улучшить разделе­ние фрагментов, и ионизационная резонансная спектроско­пия - метод, улучшающий выявление стабильных изотопных меток. Эти технологии могут при понижении удельных затрат ускорить секвенирование на порядок.

Однако, даже этого недостаточно для успешного секвени­рования всего генома. Последовательность оснований боль­шей его части будет, по-видимому, выявлена с помощью без- гелевых технологий секвенирования третьего поколения, ко­торые должны увеличить эффективность секвенирования на несколько порядков. Эти развивающиеся в настоящее время методы включают флуоресцентное определение индивидуаль­ных меченых оснований при проточной цитометрии; прямое чтение последовательности оснований с цепочки ДНК с по­мощью сканирующей туннельной или атомной микроскопии; масс-спектрометрию последовательностей ДНК; секвениро­вание при гибридизации с панелями коротких олигонуклеоти- ⁴дов известной последовательности.

45нет