Болезней обмена веществ

Что касается заместительной терапии ферментами, де­фектными при различных НБО, то при всей очевидной про­стоте идеи до недавнего времени она не могла быть реализо­вана по ряду причин, из которых основной является слож­ность доставки фермента в необходимое для его работы мес­то, особенно если при этом надо преодолеть несколько есте­ственных барьеров, представленных клеточной мембраной и мембраной соответствующих клеточных органелл. Только в последние годы получены обнадеживающие результаты фер- ментотерапии недостаточности аденозиндезаминазы и неней­ропатической формы болезни Гоше I типа. В то же время широкое использование ферментотерапии для лечения НБО, даже таких как лизосомные болезни накопления, по-видимо- му, является делом будущего.

15*5. Генотерапия

Новое направление в лечении наследственных болезней — так называемая генотерапия, которую многие исследователи рассматривают как фармакотерапию XXI в.

Генную терапию можно определить как набор методов ле­чения, основанного на переносе генетического материала в организм человека. Необходимыми условиями генной тера­пии наследственных болезней являются как минимум иден­тификация и клонирование гена соответствующего заболева­ния и более или менее полные представления о его патогене­зе. Последние 10 лет характеризовались беспрецедентным ро­стом числа картированных генов у человека. Выделение ге­нов человека сразу дает предпосылки для создания с их по­мощью продуктов, которые могут быть использованы как ле­карственные средства. Технологию рекомбинантных ДНК уже используют в фармакологической промышленности для получения лекарственных средств на основе продуктов генов человека, в том числе гормонов (инсулин и гормон роста), факторов свертывания крови (фактор VIII, IX и тканевый ак­тиватор плазминогена), р-, у- и а-интерферона, интерлейки­на-2, эритропоэтина и др.

Теоретически генотерапию можно применить для лечения самых разнообразных заболеваний человека: моногенных, мультифакториальных, в том числе онкологических, инфек­ционных, дегенеративных неврологических и т.д. Обязатель­ное условие — достаточно хорошее знание патогенеза заболе­вания, по крайней мере тех его звеньев, которые являются, с одной стороны, геноконтролируемыми, а с другой — крити­чески важными в процессе развития заболевания. Для моно­генных заболеваний ситуация упрощается, так как генотера- пия может планироваться даже в том случае, когда мы не знаем патогенез заболевания, но знаем, функция какого гена должна быть исправлена.

Принципы, используемые при генотерапии моногенных заболеваний, одинаково применимы и к генотерапии любых других заболеваний. Известно, по-видимому, не менее 4000 моногенных наследственных болезней, и их число, теперь уже медленнее, чем это было раньше, растет. Моногенные заболевания поражают все органы и системы органов, значи­тельная их часть проявляется в виде синдромов. По типу на­следования различают рецессивные заболевания, среди кото­рых значительную часть составляют наследственные болезни обмена веществ (считается, что они являются наиболее перс­пективным объектом для генотерапии), доминантные заболе­вания, причиной которых во многих случаях служат мутации в генах структурных белков (теоретически менее удобный объект для генотерапии) и сцепленные с X-хромосомой забо­левания как рецессивные, так и доминантные. К настоящему времени картировано примерно 1500 генов наследственных болезней и по крайней мере несколько сотен генов иденти­фицировано, т.е. для этих генов выполнено одно из условий их использования в качестве генотерапевтического средства.

Генотерапия моногенных, как, впрочем, и других заболе­ваний, может быть реализована при выполнении ряда усло­вий. Прежде всего должен быть выделен соответствующий ген с его регуляторными последовательностями. Существует два основных класса регуляторных последовательностей. Во-первых, это цис-регуляторные последовательности, т.е. расположенные в той же хромосоме, что и регулируемый ген. Цис-регуляторные последовательности могут выступать в ка­честве промоторов, в этом случае они располагаются непо­средственно за З’-концом от инициирующей последователь­ности гена. Цис-регуляторные последовательности могут действовать как энхансеры, тогда они могут быть расположе­ны в любой ориентации и на любом расстоянии от регулиру­емого гена. Во-вторых, это транс-регулирующие последовате­льности, которые могут быть расположены в других хромосо­мах и действуют на оба гомологичных аллеля. Считают, то при трансгенозе соответствующий ген должен переноситься с цис-регулирующими последовательностями, а транс-действу­ющие регуляторные белки будут поставляться клеткой-реци­пиентом. Сведения о требуемых для регулируемой экспрес­сии трансгенов цис-расположенных регуляторных элементах были почерпнуты в основном из экспериментов с трансген­ными мышами. Оказалось, что в некоторых случаях для адек­ватной экспрессии «чужого» гена достаточно его перенести вместе с промотором, в то время как в других случаях в пере­носимую генетическую конструкцию для ее регулируемой эк­спрессии, как, например, для генов а- или р-глобина, кроме пучков соответствующих генов, необходимо вводить регуля­торные области, расположенные на значительном расстоянии от самих генов.

Многие полагают, что в общем виде гены «домашнего хо­зяйства» не требуют очень точной регуляции для их экспрес­сии, в то время как генам, действующим тканеспецифически, такая регуляция необходима.

Для успешной генотерапии соответствующий изолирован­ный ген должен быть эффективно доставлен в клетки-мише­ни. В настоящее время используют различные методы перено­са генов (табл. 15.6), в том числе физические (прямая инъек­ция в ткань «голого» гена, кальцийфосфатная трансфекция, перенос с помощью липосом, электропарация и др.), перенос генов с помощью ретровирусов или других вирусных векто­ров, прицельную доставку генов в определенный тип клеток с использованием рецепторов этих клеток и некоторые дру­гие методы.

Эти методы различаются по эффективности доставки ге­нетических конструкций в клетки-реципиенты. Физические методы считаются наименее эффективными: трансфицирует­ся небольшой процент клеток-реципиентов, лизосомы разру­шают проникшую в клетку чужеродную ДНК и в результате только в отдельных клетках, подвергнутых обработке, введен-

Методы	Эффективность трансдукции	Эффективность интеграции
Химические
Кальцийфосфатная трансформация	Низкая	Низкая
Физические
Электропарация	Низкая	Низкая
Микроинъекции	Высокая	Низкая
Бомбардировка частицами	Высокая	Низкая
Слияние
Липосомы	Низкая	Низкая
Эндоцитоз с участием рецепторов
Комплекс ДНК—белок	Высокая	Низкая
Комплекс ДНК—оболочка вируса	Высокая	Низкая
Рекомбинантные вирусы
Аденовирус	Высокая	Низкая
Аденоассоциированный вирус	Высокая	Высокая
Вирус герпеса	Низкая	Низкая
Вирус человеческого иммунодефицита	Высокая	Высокая
Вирус Moloney	Высокая	Высокая
Вирус оспенной вакцины	Высокая	Низкая

ные генетические конструкции оказываются встроенными в геном этих клеток. Тем не менее было показано, что даже при обычной инъекции ДНК в мышцы она способна прони­кать в мышечные клетки и экспрессироваться там в течение года. Вирусные векторы более эффективно переносят встро­енные в них генетические конструкции в клетки-мишени, при этом ретровирусные векторы инфицируют делящиеся клетки и интегрируются случайным образом в их геном вмес­те со встроенными генетическими конструкциями, а адено­вирусные векторы, напротив, трансфицируют неделящиеся клетки и не встраиваются в их геном. В качестве вирусных векторов для доставки генетических конструкций в клетки- мишени использовали также аденоассоциированные вирус­ные векторы, которые неслучайным образом встраиваются в определенный район хромосомы 19, векторы на основе виру­са герпеса, вируса противооспенной вакцины и вируса чело­веческого иммунодефицита и др. Все вирусы, кроме аденоас- социированного вируса, когда их используют в качестве век­торов, генетически модифицируются, поэтому они оказыва­ются неспособными к самостоятельной репликации в клетке- хозяине, но сохраняют способность инфицировать эти клет­ки, а также избегать деградации лизосомами. Вирусные век­торы обладают в большей или меньшей степени выраженным тропизмом к определенной ткани, Что может быть использо­вано для направленной доставки генотерапевтической конст­рукции. Так, аденовирус тропен к эпителию дыхательных пу­тей, вирус герпеса — к нейронам ЦНС, вирус гепатита — к клеткам печени и т.д. Вирусные векторы отличаются также по способности встраивать большие или меньшие отрезки чужеродной ДНК и по ряду других характеристик, важных в плане их применения для переноса генов человека.

Следует упомянуть также о возможности переноса и обес­печения функционирования человеческих генов в составе ис­кусственных хромосом. Такие хромосомы могут нести боль­шие отрезки ДНК, содержащие несколько генов со всеми ре­гулирующими последовательностями. Примером искусствен­ных хромосом могут служить YAC. Требуется, однако, проде­лать еще значительную работу, для того чтобы установить, какие центро- и теломерные участки хромосом должны быть в составе этих искусственных хромосом для успешного реп- лицирования в митозе.

Для направленной доставки генетической конструкции, предназначенной для генотерапии, в определенный тип кле­ток, помимо вирусов, используют и другие способы. Ген или его переносчик могут быть прикреплены к комплексу поли­лизин — асиалогликопротеин. Такой комплекс захватывается рецепторами гепатоцитов, и в результате генетическая конст­рукция проникает в печеночную клетку и может начать в ней функционировать.

Проблема направленной доставки соответствующего ре­комбинантного гена просто решается в том случае, когда клетки определенного типа (лимфоциты, стволовые гемопоэ- тические клетки, фибробласты, кератиноциты или гепатоци- ты) извлекаются из организма, трансфицируются in vitro и после культивирования или непосредственно после транс­фекции возвращаются в организм (генотерапия ex vivo).

Таким образом, к началу 90-х годов XX в. был накоплен достаточно большой экспериментальный опыт по созданию генетических конструкций, конструированию различных пе­реносчиков для этих конструкций, трансфекции ими различ­ных типов клеток in vitro и in vivo, чтобы можно было при­ступить к собственно генотерапии моногенных заболеваний. В списке моногенных наследственных заболеваний, наиболее подходящих для генотерапии, значительную часть составляют наследственные болезни обмена веществ, такие как болезнь Гоше (сфинголипидоз), синдромы Хантера и Гурлера (муко- полисахаридозы), фенилкетонурия, гипераммониемия, цит- руллинемия, синдром Леша—Найяна (недостаточность ги- поксантин-фосфорибозилтрансферазы), метахроматическая лейкодистрофия (недостаточность арилсульфатазы А), на­следственные иммунодефициты, обусловленные недостаточ­ностью аденозиндезаминазы и пуриннуклеозидфосфорилазы и др. В список также вошли такие неметаболические заболе­вания, как гемофилии А и В, связанные с недостаточностью VIII и IX факторов свертывания крови, семейная гиперхоле- стеринемия (недостаточность рецепторов липопротеинов низкой плотности), муковисцидоз (недостаточность муковис- цидозного белка — регулятора трансмембранной проводимо­сти), миодистрофия Дюшенна (недостаточность дистрофина) и некоторые другие заболевания. К этому списку за послед­ние годы добавилось еще несколько наследственных болез­ней, кандидатов для генотерапии: наследственные нефриты, наследственные ретинопатии, некоторые формы тугоухости.

Начиная с 1989 г., когда был разрешен первый протокол для клинических испытаний генотерапии, было одобрено не­сколько сотен протоколов, которые предусматривали испыта­ния генотерапии на нескольких тысячах больных. В абсолют­ном большинстве случаев реализация этих протоколов означа­ла разные фазы клинических испытаний генотерапии онколо­гических и других мультифакториальных заболеваний, однако по крайней мере несколько десятков протоколов касалось клинических испытаний генотерапии при моногенных заболе­ваниях. Наиболее очевидный эффект, включая существенное уменьшение или даже исчезновение клинической симптома­тики, достигнут при генотерапии врожденного наследственно­го иммунодефицита, обусловленного недостаточностью аде­нозиндезаминазы. При этом заболевании собственные лимфо­циты больных после иммуностимуляции трансфицировали ретровирусным вектором, содержащим нормальный ген аде­нозиндезаминазы, после чего их возвращали в кровоток боль­ного. Всю генотерапевтическую процедуру периодически по­вторяли. Уже после первых трансфузий генетически изменен­ных лимфоцитов не только наблюдалось восстановление им­мунологических и биохимических показателей у больных, но и существенно улучшалась клиническая картина. Если первые клинические испытания генотерапии недостаточности адено­зиндезаминазы еще вызывали критику и не считались дока­занными, то теперь практически не осталось сомнения в эф­фективности генотерапии этого заболевания.

В отношении других наследственных болезней добиться столь же значительных успехов в генотерапии пока не уда­лось, и в лучшем случае протоколы предусматривали реали­зацию 1-й фазы клинических испытаний, т.е. доказательства возможности переноса гена и обнаружения его эффектов на биохимическом — физиологическом уровне.

Клиническая генетика является прикладной ветвью меди- цинской генетики. Ее основным предметом служит оказа­ние медицинской помощи больным с наследственной па- тологией и их семьям, которое заключается в диагностике, лечебных мероприятиях, медико-генетическом консульти­ровании и пренатальной диагностике наследственной и врожденной патологии.

Существует два подхода к профилактике наследствен­ных болезней: семейная профилактика с помощью пред­отвращения новых случаев заболевания в семье и популя­ционная профилактика, базирующаяся на специальных программах скрининга в отношении той или иной наслед­ственной патологии или гетерозиготного носительства му­тантных генов, а также на различных санитарно-гигиени- ческих мероприятиях, направленных на выявление вред­ных производственных факторов и неблагоприятных вли­яний окружающей среды.

Ме дико-генетическое консультирование можно опре­делить как коммуникативный процесс, связанный с реше­нием проблем семьи с риском возникновения наследст­венного заболевания и заключающийся в попытке помочь семье, обеспечив ее данными о диагнозе и возможном клиническом течении болезни, доступном лечении, типе наследования заболевания и риске его повторения среди ближайших родственников, принять адекватное решение о дальнейшем репродуктивном поведении.

Генетический риск — это специфическая вероятность (от 0 до 1) появления определенной наследственной пато­логии у самого обратившегося либо у его потенциальных потомков, а также других родственников. Различают низ­кий (до 5 %), средний (от 6 до 20 %) и высокий (выше 20 %) риск появления больного с наследственной бо­лезнью в семье. Существует два способа определения ге­нетического риска: теоретические расчеты, основанные на генетических закономерностях, и использование эмпири­ческих данных.

Генетический скрининг можно определить как выявле­ние в популяции лиц с определенным генотипом, который либо обусловливает заболевание или предрасполагает к возникновению заболевания, либо может обусловить за­болевание у потомства.

В медицинской генетике в настоящее время широко используют следующие виды генетического скрининга: 1) популяционный скрининг новорожденных с целью вы­явления и последующего лечения некоторых наследствен­ных болезней обмена веществ (фенилкетонурия, гипоти­реоз, галактоземия); 2) популяционный скрининг для об-

наружения гетерозиготного носительства генов некоторых наследственных заболеваний, частых в тех популяциях, где организуется скрининг, с целью дальнейшего медико­генетического консультирования семей с высоким риском и пренатальной диагностики в этих семьях пораженных плодов.

В медицинской генетике находят все большее примене­ние методы пренатальной диагностики. Эти методы мож­но разделить на скринирующие и диагностические. К скринирующим методам можно отнести анализ сыворо­точных маркеров и массовое ультразвуковое обследование беременных, а к диагностическим — амниоцентез, био­псию ворсинок хориона, кордоцентез и в некоторых слу­чаях прицельное ультразвуковое исследование плода. Скринирующие методы применяют для выявления группы риска среди беременных в отношении врожденных поро­ков развития, а также некоторых хромосомных синдромов у плода. Для семей из этих групп риска, а также для семей с разнообразной моногенной наследственной патологией, для которой возможна ДНК-диагностика, при желании семьи может быть проведена инвазивная подтверждающая диагностика.

В настоящее время примерно для 30 наследственных болезней обмена веществ разработана эффективная пато­генетическая терапия. Концептуальной основой диетиче­ского лечения наследственных метаболических заболева­ний является идея, что в результате блока в определенном метаболическом пути происходит накопление предшеству­ющего блоку метаболита и продуктов его деградации, ко­торые действуют токсически, и лечение должно заключа­ться в обходе этого метаболического блока или его прео­долении.

Последним достижением медицинской генетики явля­ется разработка методов генотерапии для лечения различ­ных заболеваний человека: наследственных, мультифакто- риальных и даже инфекционных. Успех генотерапии зави­сит от создания методов эффективной доставки генов в нужные соматические клетки, создания генетических кон­струкций, обеспечивающих высокую активность перене­сенного гена и от обеспечения достаточно длительного функционирования перенесенного гена в соматических клетках.