2. Рекомбинация фрагментов днк

Р

Рис. 7.1. Липкие и тупые концы, обра­зующиеся после рестрикции двойной нити ДНК рестриктазами Hind III и Нра I.

Черным цвехом выделены последовательно­сти нуклеотидов, распознаваемые рестрик­тазами.

гц ЦГ	А А Г Ц Т Т Т Т Ц Г А А		ЦТ ГА
А А Т Т	Г Т Т Ц А А	А А Ц Т Т Т	Г Г ЦЦ

естриктазы разрезают обе нити ДНК, которые в результа­те образуют либо тупые (как в случае Нра 1), либо липкие (как для остальных рестриктаз, показанных в табл. 7.1) кон­цы (рис. 7.1). ДНК одного организма разрезается определен­ной рестриктазой в строго определенных местах, поэтому та­кая ДНК после рестрикции (которую также называют перева­риванием) всегда будет давать один и тот же набор фрагмен­тов. Если использовать один вид рестриктазы для разрезания ДНК из разных организмов, то набор фрагментов окажется различным, но последовательность нуклеотидов в местах раз­

резания будет у всех фрагментов одной и той же и, следовате­льно, комплементарной друг другу при образовании у фраг­ментов липких концов. Последние называют липкими, по­скольку из-за комплементарности они могут соединяться с другими фрагментами, образованными той же самой реет- риктазой или другой рестриктазой, образующей такие же концы. Объединение фрагментов, обладающих липкими ком­плементарными концами, ускоряется и стабилизируется спе­циальным ферментом, который называют лигазой. Таким об­разом, если одной рестриктазой разрезать ДНК двух разных видов и смешать фрагменты, то может образоваться совер­шенно новая, не существующая в природных условиях моле­кула рекомбинантной ДНК.

Для того чтобы интересующий исследователя фрагмент ДНК можно было секвенировать, его необходимо размно­жить. Это можно сделать двумя разными методами, перемес­тив его в клетку хозяина или размножив его in vitro.

3. Внедрение фрагментов днк в клетку хозяина с помощью векторов

Для перемещения фрагмента ДНК в клетку хозяина обыч­но используют специальные конструкции, которые называют векторами, Наиболее часто в качестве векторов применяют бактериальные плазмиды¹, бактериофаги¹, космиды², бакте риальные³ и дрожжевые⁴ искусственные хромосомы. Недавно было предложено использовать в качестве векторов искусст­венные хромосомы человека⁵. Исследуемый фрагмент ДНК встраивается в соответствующий вектор (рис. 7.2). Вектор до­ставляет этот фрагмент в клетку хозяина (обычно бактериа­льные клетки для облегчения встраивания вектора обрабаты­вают специальным методом), где он проходит независимую от хозяина репликацию, так что образуются многочисленные копии исследуемого фрагмента ДНК или, иными словами, происходит его клонирование. Как правило, векторы транс­формируют относительно небольшое число бактериальных клеток.