5. Создание геномных библиотек

Рестрикция геномной ДНК на фрагменты и клонирова­ние фрагментов с помощью различных векторов создали основу формирования геномных библиотек. Для этого геном­ная ДНК разрезается или, как говорят, переваривается определенной рестриктазой, а образующиеся фрагменты клонируются с помощью различных векторов, для чего ис­пользуют методы рекомбинантной ДНК. Геномная библиоте­ка должна содержать не только гены, но и всю некодирую­щую ДНК, расположенную между генами. Поскольку пере­варивание рестриктазой производят неполное так, что одни сайты, специфические для рестриктазы, разрезаются, а дру­гие нет, то образуются фрагменты ДНК с частично перекры­вающимися последовательностями нуклеотидов. Это облег­чает последующее восстановление картины расположения фрагментов в нативной ДНК. Кроме геномных библиотек,

Переваривание ферментами рестрикции

Фрагменты ДНК после рестрикции

/

/

Инкубация с меченым зондом ДНК, идентификация искомого фермента

Перенесение на мембрану и денатурация

Разделение фрагментов ДНК по размерам при электрофорезе в геле

Рис. 7.3. Метод Саузерн-блоттинга для идентификации определен­ного фрагмента ДНК, или гена.

существуют библиотеки кДНК. Они содержат только экзоны генов, поскольку получаются на основе зрелой мРНК с по­мощью фермента, называемого обратной транскриптазой. Обратная транскриптаза на матрице мРНК создает компле­ментарную нить ДНК, которая затем превращается в обыч­ную двунитевую ДНК с помощью ДНК-полимеразы. Затем такие молекулы кДНК клонируются в бактериальных клет­ках точно так же, как и геномная ДНК. Еще один тип ДНК-библиотек — хромосомоспецифические библиотеки. Для их создания хромосомы разделяют с помощью проточной цитометрии, которая позволяет выделить отдельные хромо­сомы. ДНК, полученная после такой сортировки, будет пре­имущественно представлять определенную хромосому. Затем получают фрагменты ДНК отдельной хромосомы перевари­

ванием с той или иной рестриктазой и клонируют их обыч­ным путем. Различные библиотеки ДНК широко использу­ют при реализации программы «Геном человека», а также для других целей, например при поиске полиморфных ДНК-маркеров.

6. Клонирование последовательностей днк с помощью полимеразной цепной реакции (пцр)

Кроме описанного способа клонирования последователь­ностей ДНК in vivo, существует также способ клонирования in vitro, который получил название полимеразной цепной реак­ции (ПЦР).

Обязательным условием для проведения ПЦР является знание последовательности нуклеотидов, фланкирующих клонируемую последовательность. Для проведения ПЦР не­обходимо предварительно синтезировать пару так называе­мых праймеров, которые представляют собой олигонуклеоти­ды, т.е. короткие последовательности нуклеотидов (пример­но по 20 п.н.), комплементарных фланкирующим последо­вательностям размножаемого фрагмента ДНК. После дена­турации изучаемого фрагмента ДНК, т.е. его разделения на две нити при высокой температуре (94 °С), температуру снижают примерно до 55 °С, в реакционную смесь добавля­ют праймеры, которые комплементарно связываются с соот­ветствующими участками этих нитей, и особую термоста­бильную ДНК-полимеразу, а также набор из 4 свободных нуклеотидов. ДНК-полимераза на каждой цепи достраивает комплементарную цепь (достраивание цепей ДНК произво­дят при промежуточной температуре, обычно при 72 °С). За­тем следует денатурация вновь образованных ДНК цепей с помощью температурной обработки, к которой ДНК-поли­мераза не чувствительна. К вновь образованным нитям фрагмента ДНК снова присоединяются свободные прайме­ры, и достраивание комплементарных цепей с помощью ДНК-полимеразы происходит теперь уже на 4 нитях иссле­дуемой ДНК. Затем снова следует денатурация вновь обра­зованной ДНК, и цикл достраивания повторяется теперь уже на 8 нитях (рис. 7.4).

Так может повторяться до бесконечности или до исчерпа­ния свободных нуклеотидов в реакционной смеси, но обыч­но 20—30 циклов хватает, чтобы получить достаточное ко­личество ДНК изучаемого фрагмента для любых последую­щих манипуляций с этим фрагментом. Температурный ре­жим в каждом цикле сохраняют таким же, как и для первого цикла.

размножения Цикл 1

Исходный фрагмент ДНК

Денатурация ДНК и отжиг праймеров

Г^{1,1 J 111}1

^ i'» i i » *

ДНК-полимераза

Достраивание

комплементарных

цепей

‘ттптН Mill L.1.J 11 111111111ДЩ .

ДНК-полимераза

Ц

^ f i * i i г-¹

икл 2

Денатурация ДНК и отжиг праймероа

I Ч 111 ■ 1IIIД111 ГГ ГГ 1 i ГI

I

3

Достраивание

комплементарных

цепей

I I тттТ

у ч rnyn iih i Цч j, 111

К

XXL

Б

Цикл 3

IIII I I

Д

1111 11

енатурация ДНК и отжиг праймероа

Д

п

п

п

ЕШП

остраивание

комплементарных

ц

тт

епей

тт

П

п

И

I 111111 ■ I гш

Цикл 4—30

Рис. 7.4. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

7. Методы анализа структуры ДНК

Одна из таких манипуляций, может быть, самая важная в программе «Геном человека», заключается в секвенировании фрагментов ДНК, т.е. определении последовательности нук­леотидов во фрагменте. Именно эта процедура позволяет, в частности, расшифровать структуру гена, установить природу мутаций в нем, определить аминокислотную последователь­ность в молекуле белка, кодируемого этим геном, и т.д.

Наиболее распространенным методом, который использу­ют для секвенирования ДНК, является метод, разработанный Фредериком Сэнгером. Этот метод называется еще дидезокси- методом, поскольку в нем применяют дидезоксинуклеотиды для терминации синтеза цепи ДНК. Дидезоксинуклеотиды похожи на обычные нуклеотиды, но в них отсутствует З’-гид- роксильная группа, и это препятствует образованию фосфо- диэфирной связи со свободным нуклеотидом. В результате дидезоксинуклеотид, присоединившись к растущей цепи ДНК, этот синтез прекращает.

Чтобы осуществить сиквенс фрагмента ДНК, его сначала разделяют на две нити. Эти нити смешивают с радиоактивно меченным коротким праймером, смесью из 4 обычных нук­леотидов, ДНК-полимеразой и с одним из 4 дидезоксинукле- отидов (А,Т,Г,Ц), поэтому одновременно реакция синтеза с одним фрагментом ДНК идет в 4 пробирках, которые отлича­ются только по содержанию в ней определенного дидезокси- нуклеотида. Репликация начинается с синтезированного от­резка ДНК, комплементарного праймеру, который присоеди-

З'С ААЦАГЦТАГАГТЦАЦТГГАТ ) 5'

/Т1~ mi

Гттгтц) ■

^{4 у} Щ ДНК-полимераза,

Праймер | дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ

З'СААЦАГЦТАГАГТЦАЦТГГАТ ) 5’ ТПП

ддЦТФ ^ДддТТФ

Фрагменты ДНК, после

электрофореза,

выявляемые

радиоавтографией

(ттгтц)

Ц

Г

А

ц

А

А

Т Известная Г последовательность Т праймера Т

Рис. 7.5. Сиквенс ДНК с использованием метода Сэнгера (объясне­ния см. в тексте).

няется к комплементарной последовательности нити ДНК, и ДНК-полимераза, начиная от праймера, достраивает компле­ментарную цепь. Как только к этой цепи присоединяется ди- дезоксинуклеотид, ее синтез прекращается. Поскольку при­соединение дидезоксинуклеотида происходит случайно, так как в реакционной смеси есть его нормальный аналог, то в каждой пробирке образуется набор цепей разной длины. Од­нако каждая цепь заканчивается соответствующим дидезок- синуклеотидом, который, напомним, разный в разных про­бирках. В результате осуществляется мечение всех позиций в цепи, где находится каждый из 4 нуклеотидов. Чтобы эту метку выявить, достаточно с помощью электрофореза рас­пределить цепи, образованные в каждой пробирке, по длине. Для этого проводят электрофорез продуктов синтеза цепей ДНК в каждой пробирке на одной пластинке рядом друг с другом, чтобы можно было сравнить положение каждого фрагмента по отношению к другим фрагментам. Так как каж­дая полоска на электрофореграмме будет соответствовать цепи ДНК, заканчивающейся одним из 4 нуклеотидов, то по­следовательность нуклеотидов в цепи может быть легко про­читана по тому порядку полос на геле (снизу вверх), который выявляется после радиоавтографии (радиоавтография обеспе­чивается тем, что в каждой синтезированной цепи ДНК есть радиоактивно меченный праймер) (рис. 7.5).

Реализация программы «Геном человека» потребовала раз­работки более быстрых методов сиквенса ДНК. Были разра­ботаны на основе только что изложенного принципа методы автоматического сиквенса, в которых используют мечение либо праймеров, либо дидезоксинуклеотидов флюоресцент­ной или хемилюминесцентной меткой, выявляемой специа­льной лазерной системой обнаружения метки во время элек­трофореза. Сигналы из лазерной системы детекции поступа­ют в компьютер, где на основе специальной программы они интерпретируются в терминах нуклеотидов, обозначаемых пиками разного цвета на мониторе компьютера. Автоматиче­ские секвенаторы позволяют ускорить получение результатов сиквенса в десятки или даже в сотни раз по сравнению с руч­ным сиквенсом. К июню 2000 г. группы, осуществлявшие сиквенс генома человека, проводили его со скоростью, экви­валентной однократному покрытию генома в течение 6 нед.

3. ПРОГРАММА «ГЕНОМ ЧЕЛОВЕКА»

Когда создавалась программа «Геном человека», были определены три основные цели этой программы: создание точной генетической карты, создание физической карты ге­нома человека и сиквенс всего генома человека.