4. Скрининг клеток-хозяев на рекомбинантный вектор и отбор интересующих исследователя клонов

После того как трансформированные бактериальные клет­ки размножатся в культуральной среде, их рассевают на пита­тельный агар в чашки Петри. Обычно, чтобы облегчить скри­нинг трансформированных бактерий, чужеродная ДНК встраивается в вектор таким образом, что она разрушает ген устойчивости к какому-либо антибиотику. В результате трансформированная клетка оказывается чувствительной к этому антибиотику и ее можно выявить на селективном агаре

ДНК

Ф

Рестрикция ДНК человека и плазмидной ДНК одной и той же рестриктазой

j 1_

Плазмида

Открытая плазмида

рагмент ДНК для клонирования

В

Гибридная плазмида с рекомбинантной ДНК

стройка фрагмента в плазмидную ДНК

Рис. 7.2. Встраивание исследуемого фрагмента ДНК в бактериаль­ную плазмиду, которая может быть использована как вектор для клонирования этого фрагмента.

с добавлением соответствующего антибиотика. Для этого с исходной чашки Петри с выросшими на ней колониями де­лают реплики методом отпечатков. Колонии, выросшие на репликах, сравнивают с колониями на исходной чашке Пет­ри и выявляют колонии, возникшие из трансформированной бактериальной клетки. Клонированную чужеродную ДНК можно теперь обнаружить с помощью ее гибридизации с ра­диоактивно меченной пробой или зондом ДНК. Зонды ДНК или РНК представляют собой однонитевые последовательно­сти, меченные либо радиоактивным фосфором, либо нуклео­тидами, меченными флюоресцентными красителями. Они могут быть получены из разных источников. В зависимости от цели, преследуемой исследователем, это могут быть после­довательности генов, мРНК, кДНК¹, олигонуклеотидные по­следовательности, синтезированные химическим путем и представляющие собой нуклеотидные последовательности, кодирующие часть какого-то белка и т.д.

^!кДНК — это последовательность нуклеотидов, полученная с помо­щью обратной транскрипции молекулы мРНК, что может быть достиг­нуто при использовании особого фермента, обратной транскриптазы. Следовательно, кДНК представляет собой кодирующую часть гена.

Для того чтобы с помощью ДНК-зонда выявить, есть ли среди клонированных фрагментов ДНК комплементарные зонду последовательности, его необходимо гибридизовать с этими фрагментами, которые предварительно должны быть денатурированы, т.е. превращены в однонитевые структуры или щелочью, или нагреванием. Такая процедура гибридиза­ции зонда ДНК, конечно, может быть осуществлена не то­лько с клонированными, но и любыми другими последова­тельностями ДНК, полученными, например, после рестрик­ции геномной ДНК и т.д. Гибридизацию зонда ДНК с фраг­ментами ДНК, полученными после клонирования или рест­рикции или того и другого, производят после их электрофо­реза в агарозном геле, где они распределяются в соответст­вии с размерами (чем короче фрагмент, тем быстрее он дви­жется в геле), денатурации и перенесения на нитроцеллю- лозный или нейлоновый фильтр, с которым однонитевые последовательности ДНК прочно связываются. Метод пере­несения однонитевых фрагментов ДНК на фильтр и их свя­зывания с фильтром получил название по имени его созда­теля Саузерн-блоттинга. Если на приготовленный таким об­разом фильтр наносят меченный тем или иным способом зонд ДНК, то при наличии на фильтре искомого фрагмента ДНК происходит его гибридизация с зондом, что можно вы­явить с помощью радиоавтографии либо люминесцентного окрашивания (рис. 7.3). Если искомым фрагментом является мРНК, то процедуру ее связывания с фильтром называют Нозерн-блоттингом. Нозерн-блоттинг используется нередко для выявления временных и тканевых особенностей прояв­ления генов.