Клинические симптомы

Гиперкератоз ладоней и подошв

Гиперкератоз ладоней и подошв неэпидермоли- тический, поражение кожи в области рта и ге­ниталий

Онихогрипоз, гиперке­ратоз ладоней и подошв, коленей и локтей, стеа- тоцитома, лейкоплакии во рту, сублингвальный гиперкератоз, молочные зубы, поражение горта­ни, умственная отста­лость, алопеция

Ихтиозиформная эрит­родерма врожденная, не­буллезная, умственная отсталость, задержка ро­ста, спастический пара­лич, гипоплазия генита­лий, гипотрихоз «Коллодиевый» плод, десквамация у новорож­денного, потеря белка и электролитов через кожу, иногда сепсис

Гипертрофический их­тиоз, особенно на голо­ве, шее, ушах, темные чешуйки кожи, помутне­ние роговицы, начало в возрасте 6 мес

5.10. Молекулярная диагностика моногенных наследственных болезней

До недавнего времени диагностика моногенных наследст­венных болезней основывалась исключительно на особенно­стях фенотипического проявления заболевания. Только при некоторых наследственных болезнях обмена веществ диа­гностику проводили, определяя уровень измененных мета­болитов или даже измененного фермента. Фенотипический уровень диагностики иногда был достаточным для решения некоторых проблем клинической генетики, например для выбора тактики лечения клинически сходных, но генетиче­ски весьма гетерогенных заболеваний, таких как нервно- мышечные заболевания или пигментная дистрофия сетчатки и т.д. Правда, лечение в этих случаях было чисто симптома­тическим. Достижения в области молекулярной генетики позволяют для многих моногенных заболеваний перевести диагностику на уровень определения изменений в генотипе. Из предшествующего текста главы ясно следует, что такая ДНК-диагностика в некоторых случаях принципиально ме­няет представления о классификации наследственных бо­лезней и открывает новые возможности для патогенетиче­ского лечения наследственных болезней. Кроме того, ДНК-диагностика является мощным инструментом для пре­натальной диагностики наследственных болезней, когда точность диагностики абсолютно необходимое условие для выполнения одного из основных постулатов медицины «не вреди!».

Все методы ДНК-диагностики наследственных болезней можно разделить на прямые и непрямые. Как прямые, так и непрямые методы ДНК-диагностики весьма разнообразны. Прямые методы анализа имеют ряд преимуществ. Для них нет необходимости изучать других членов семьи или учиты­вать возможные рекомбинации в гене. Нет также проблемы недостаточной информативности генетических маркеров.

Если мутация, вызывающая то или иное наследственное заболевание, изменяет сайт рестрикции для определенной рестриктазы, то для прямой диагностики может быть исполь­зован метод анализа ПДРФ (полиморфизм длины рестрикци­онных фрагментов) (рис. 5.9). Недостатком этого метода яв­ляется то, что мутации, вызывающие моногенные заболева­ния, изменяют или удаляют сайт рестрикции для разных ре- стриктаз в относительно небольшом проценте случаев.

Если последовательность нуклеотидов, предшествующих мутации и следующих за мутацией, известна, то для прямой диагностики мутации могут быть использованы олигонуклео- тидные зонды, которые будут гибридизоваться только либо с мутантной, либо с нормальной последовательностью нуклео-

И

Сайты рестрикции в норме

счезновение сайта рестрикции в результате мутации

i

i

i

i

2

5 тыс.п.н.

5 тыс.п.н.

тыс.п.н. 3 тыс.п.н.

3 тыс.п.н. 2 тыс.п.н.

Рис. 5.9. Прямой метод ДНК-диагностики мутации с помощью ПДРФ.

В результате мутации в гене исчезает сайт рестрикции для определенной ре- стриктазы. Это выявляется с помощью анализа длины фрагментов нормаль­ной и мутантной ДНК после рестрикции, электрофореза и гибридизации с зондом на соответствующий ген по Саузерну.

тидов. Эти олигонуклеотидные зонды получили название ал- лельспецифических олигонуклеотидов (АСО). АСО гибридизи­руются с геномной ДНК в жестких условиях, поэтому нару­шение спаривания даже одного нуклеотида будет препятство­вать гибридизации. Обычно длина АСО составляет 18—20 нуклеотидов.

Более короткие зонды могут быть не уникальными для ге­нома. Представим олигонуклеотидные аллельспецифические последовательности для нормальной и мутантной ДНК и ре­зультаты их гибридизации с нормальными и мутантными го­мозиготами, а также с гетерозиготами, которые приводят к образованию гомо- и гетеродуплексов, различимых при элек­трофорезе/

Аллельспецифическая

олигонуклеотидная T—Г—Ц—T—Ц—А—Г—А(1)

последовательность

для нормальной ДНК

Аллельспецифическая

олигонуклеотидная T—Г—Ц—А—Ц—А—Г—А (2)

последовательность

для мутантной ДНК

	А—Ц—Г—А—Г—Т—Ц—Т
		.Гомодуплекс
Нормальные гомозиготы + (1)	Т—Г—Ц—Т—Ц—А—Г—А Т—Г—Ц—Т—Ц—А—Г—А
	i i i i i i i i А—Ц—Г—А—Г—Т—Ц—Т	Гомодуплекс

А—Ц—Г—А—Г—Т—Ц—Т	Гомодуплекс
Гетерозиготы + (1) I I I I I I I I
Т—Г—Ц—Т—Ц—А—Г—А
А
Т—Г— LK N-)—А—Г—А I I T i i i i	Гетеродуплекс
А—Ц—Г—А—Г—Т—Ц—Т

		Т
Мутантные	А—	-ц—г/ ^Г—'Г—Ц—'т	Гетеродуплекс
гомозиготы + (1)	Т-	-Г—Ц—Т—Ц—А—Г—А
	т-	-Г—Ц—Т—Ц—А—Г—А	Г етеродуплекс
	А-	-Ц—Г\ хГ—■Г— Ц—'Г

Нормальные	А^ А— Ц—Р"	-т-ц-т	Гетеродуплекс
гомозиготы + (2)	ili i	I I I
	Т—Г—Ц—А—Ц- Т—Г—Ц—А—Ц-	-А—Г—А -А—Г—А	Г етеродуплекс
	А—Ц—Г \ /Г- А	-Т-Ц-Т

А
А—Ц—Г ^ ^Г—Г—Ц—■Г	Г етеродуплекс
Гетерозиготы + (2) I I I I I I I
Т—Г—:Ц—А—Ц—А—Г—А
Т—Г—Ц—Т—Ц—А—Г—А	Гомодуплекс
А—Ц—Г—А—Г—Т—Ц—Т

	А—Ц—Г—Т—Г—Т—Ц—Т
	II II II I I	Гомодуплекс
Мутантные гомозиготы + (2)	Т—г—Ц—А—Ц—А—Г—А Т—Г—Ц—А—Ц—А—Г—А
	А—Ц—Г—Т—Г—Т — Ц—Т	Гомодуплекс

Прямой метод определения мутации с помощью АСО име­ет преимущество перед анализом ГТДРФ, так как не требует- ся, чтобы мутация изменяла сайт рестрикции. Однако для ис­пользования этого метода необходимо, чтобы ген был секве- нирован. Кроме того, если* в гене известно много мутаций, то для каждой из них необходимы свои АСО, что может сделать этот метод непрактичным.

В качестве прямого метода ДНК-диагностики наследст­венных болезней, безусловно, может быть использован сик- венс отдельных районов или даже всего гена, техника кото­рого подробно описана в главе 7.

К прямым методам выявления мутаций относят также ме­тоды денатурирующего градиентного гель-электрофореза (DGGE) и одноцепочечного конформационного полимор­физма (SSCP). Оба метода можно рассматривать как скрини- рующие, так они не позволяют точно установить природу му­тации. В методах используют то, что при определенных усло­виях мутации изменяет подвижность фрагментов ДНК при электрофорезе в геле. Используют также и другие методы прямого молекулярно-генетического анализа.

Основным непрямым методом ДНК диагностики наслед­ственных болезней является анализ сцепления, который будет подробно изложен в главе 9, с использованием в качестве ге­нетических маркеров для поиска сцепления с геном заболе­вания разнообразных ДНК-полиморфизмов (ПДРФ, VNTR и полиморфизма микросателлитных повторов). Анализ сцепле­ния можно применить для любого картированного гена на­следственного заболевания. Он не требует изучения тонкой структуры мутантного гена. ДНК-маркеры позволяют устано­вить, унаследовал ли индивид хромосому(ы), несущую му­тантный ген или нет. Метод сцепления имеет ряд недостат­ков, среди которых — необходимость исследования большого числа родственников больного для того, чтобы установить, с какими аллелями и каким маркером сцеплен ген заболевания; необходимость учитывать возможность кроссинговера между ДНК-маркерами и геном заболевания, что не позволяет быть уверенным на 100 % в диагностике заболевания. Последнее достигается при использовании прямых методов.

Фенотипические признаки, с которыми имеет дело меди­цинская генетика, это наследственные болезни и их симп­томы. Между симптомами наследственного заболевания и изменением одного белка в результате мутации в каком-то конкретном гене дистанция огромного размера. Мутант­ный белок, продукт мутантного гена, должен каким-то образом взаимодействовать с сотнями, если не с тысяча-

ми других белков, кодируемых другими генами, чтобы в конце концов изменился какой-то нормальный признак или появился патологический признак. Кроме того, про­дукты генов, участвующие в становлении любого феноти­пического признака, могут взаимодействовать с фактора­ми окружающей среды и модифицироваться ими.

Моногенные наследственные болезни наследуются со­гласно правилам, установленным Г.Менделем. Различают аутосомно-доминантные и аутосомно-рецессивные на­следственные болезни. Родословные семей, в которых на­следуются таким образом заболевания, имеют ряд отличи­тельных характеристик. Существуют также строгие методы доказательства доминантного или рецессивного наследо­вания заболеваний.

Кроме аутосомных типов наследования, известно также наследование, сцепленное с половыми хромосомами, — хромосомами X и Y, Существует большое число наследст­венных болезней, которые наследуются сцепленно с хро­мосомой X и только несколько заболеваний, наследую­щихся сцепленно с хромосомой Y.

Развитие плода женского пола сопровождается инакти­вацией одной из хромосом X в большинстве клеток. Инак­тивация хромосом X происходит достаточно рано в разви­тии, когда в эмбрионе женского пола зачатки разных ор­ганов представлены относительно небольшим числом кле­ток, поэтому в результате примерно 50 % клеток имеют активную отцовскую, а другие 50 % — материнскую хро­мосому X.

У человека важнейшим фактором определения пола в эмбриональном развитии является хромосома Y\

Разработаны разнообразные методы прямой и непря­мой молекулярной диагностики моногенных наследствен­ных болезней.