9.6. Создание моделей наследственных болезней человека с помощью трансгенных животных

Изучение патогенеза наследственной патологии у челове­ка, особенно когда эта патология является врожденной, было бы невозможным, если бы для этих целей не исполь­зовали лабораторных животных, прежде всего мышей. Гене­тика мышей — один из наиболее развитых разделов генети­ки млекопитающих. В настоящее время заканчивается сик­венс генома мыши. У мышей создано очень большое число мутантных линий, и многие мутации у мыши по своим про­явлениям аналогичны мутациям, приводящим к развитию наследственных заболеваний человека. Эти мутантные ли­нии мышей эффективно используют как модели для изуче­ния механизма действия мутантных генов человека. Созда­ны инбредные линии мышей, моделирующие многие на­следственные болезни обмена веществ, а также наследствен­ные синдромы, скелетные, глазные и другие наследственные болезни.

Методы генетической инженерии с середины 70-х годов прошлого века стали применять для получения трансгенных животных. Эти методы основываются на введении чужерод­ных генов в клетки зародышевой линии. Принципиальная схема получения трансгенных животных заключается в мик­роинъекции ДНК в ядро либо зародышевой клетки, либо не­дифференцированной клетки очень раннего эмбриона.

Чаще всего в качестве объекта для введения чужеродного гена используют мужской пронуклеус оплодотворенного яйца. Мужской пронуклеус представляет собой достаточно крупную структуру, образованную головкой сперматозоида и расположенную недалеко от поверхности оплодотворенной яйцеклетки. Чужеродный ген инъецируют в ядро пронуклеуса и инкорпорируют в геном пронуклеуса за счет его собствен­ных ферментов рекомбинации. Теперь чужеродный ген будет наследоваться всеми клетками эмбриона, в том числе клетка­ми зародышевого пути. Обычно чужеродный ген встраивает­ся в геном случайно (эктопически). В результате он может экспрессироваться не в той ткани, в которой он экспрессиру­ется в норме, или не в нужное время, или вовсе не экспрес­сироваться. Однако эти трудности можно преодолеть созда­нием соответствующих конструкций и прежде всего подбо­ром соответствующего промотора. Вместо оплодотворенной яйцеклетки для получения трансгенных животных можно ис­пользовать клетки из ранней бластулы, сохраняющие тотипо- тентность. Эти клетки способны расти в культуре in vitro, что облегчает процедуры введения чужеродной ДНК и отбора тех клеток, в ядро которых эта ДНК встроилась. Для отбора во

Рис. 9.4. Направленное разрушение гена для создания трансгенного животного.

Клетки бластулы трансфицируются вектором, содержащим маркерный ген, фланкируемый последовательностями, которые гомологичны последовате­льностям инактивируемого гена хозяина. В результате рекомбинации мар­керный ген вставляется в последовательность гена хозяина и инактивирует его.

вводимую генетическую конструкцию, кроме интересующего исследователя гена, может быть добавлен ген резистентности к подходящему лекарству. После введения необходимой гене­тической конструкции в культивируемые клетки бластулы последние можно вернуть в эмбрион, находящийся на стадии бластоцисты, где они будут участвовать в продолжении нор­мального развития. В результате получается мозаичный орга­низм, в котором мозаичными могут быть и клетки зародыше­вого пути. Скрещивая таких особей, можно получить линию животных гетеро- и гомозиготных по введенному чужеродно­му гену.

Действуя сходным образом, можно ввести генетическую конструкцию, которая направленно может разрушить интере­сующий исследователя ген (нокаутный ген), а затем получить линию животных с инактивированным геном. Для этого кон­струкция должна содержать маркерный ген, лигированный с двух концов последовательностями, гомологичными последо­вательностям гена, который необходимо разрушить или инактивировать. В результате рекомбинаций между гомоло­гичными последовательностями гена и конструкции маркер­ный ген вставляется в ген хозяина, который необходимо инактивировать, и, таким образом, он нарушает его структу­ру (рис. 9.4).

Трансгенных животных наиболее эффективно используют для изучения функции гена и патогенеза соответствующего наследственного заболевания, т.е. в той области, которая по­лучила название функциональной геномики.

Установление точной локализации генов наследственных болезней является одной из наиболее важных задач меди­цинской генетики, так как ее решение позволяет создать метод диагностики для соответствующего наследственного заболевания. Эта задача может быть решена различными способами. Классическим методом установления локали­зации и взаимного расположения генов наследственных болезней является анализ сцепления. Этот метод преду­сматривает выявление случаев совместного наследования определенного варианта полиморфного гена и заболева­ния в семьях, что предполагает расположение полиморф­ного гена и гена заболевания в одной хромосоме. Для установления сцепления используют метод, основанный на максимально правдоподобной оценке частоты реком­бинаций (0). Такая оценка базируется на относительной вероятности (Pr) наличия сцепления между изучаемыми локусами в каждой конкретной семье. Pr рассчитывают как отношение вероятностей сцепления изучаемых локу­сов в данной семье с разной частотой рекомбинаций меж­ду этими локусами (0 = 0 до 0,5) к вероятности, что в этой семье нет сцепления по изучаемым локусам и, следова­тельно, 0 = 0,5. Для удобства Pr часто выражают через ло­гарифм. Logio этой относительной вероятности называют логарифмом шансов (log of odds), или значением логариф­ма шансов (lod score). Считают, что сцепление между ло­кусами установлено, когда сумма логарифмов шансов для исследованных семей окажется равной 3 или более. Лога­рифм шансов, равный 3, означает, что сцепление в 1000 раз более вероятно, чем его отсутствие. Напротив, при значении логарифма шансов, равном —2, сцепление между локусами в 100 раз менее вероятно, чем его отсутст­вие, и может быть отвергнуто. Полагают, что 1 % реком­бинаций соответствует расстоянию 1 см.

Использование сцепления для установления локализа­ции генов наследственных болезней стало эффективным после обнаружения различных ДНК-полиморфизмов, та­ких как ПДРФ, VNTR-полиморфизм, полиморфизм мик- росателлитных повторов и т.д., обладающих высокой ин­формативной ценностью.

Разработаны также разнообразные методы физического картирования генов наследственных болезней, в том числе картирование генов с помощью хромосомных мутаций, картирование с помощью гибридизации in situ, картирова­ние с помощью гибридизации соматических клеток и др. К началу 2002 г. картировано более 1500 генов наследст­венных болезней.

После того как ген наследственного заболевания карти­рован в определенном месте хромосомы, возникают усло­вия для его выделения, клонирования и изучения тонкой структуры, а также поиска в нем мутаций, ответственных за развитие наследственного заболевания. В результате ре­ализации программы «Геном человека» происходит опре­деленная эволюция в методах, которые используют для этих целей, и метод позиционного -клонирования генов все больше уступает место методам идентификации генов по их положению в геноме.

Для изучения патогенеза наследственной патологии у человека, особенно когда эта патология является врожден­ной, применяют лабораторных животных, прежде всего мышей, у которых найдено или специально получено бо­льшое число мутаций, сходных по своим проявлениям с мутациями, вызывающими наследственные болезни у че­ловека.

Методы генетической инженерии с середины 70-х го­дов прошлого века стали использовать для получения трансгенных животных. Эти методы основываются на вве­дении чужеродных генов в клетки зародышевой линии с последующим получением животных, в геном которых включен чужеродный ген. Нередко вводят генетическую конструкцию, которая направленно разрушает интересую­щий исследователя ген (нокаутный ген), а затем получают линию животных (чаще всего мышей) с инактивирован­ным геном. Таким образом удается достаточно точно уста­новить, какие структуры и функции у трансгенного жи­вотного повреждаются в результате полного выключения какого-то гена.